材料和试剂

Vero细胞（从ATCC获得，CCL-81）
来自患者血清的SFTSV
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）+具有L-谷氨酰胺的4.5g/L D-葡萄糖（Life Technology，目录号：C11965500BT）
胎牛血清（FBS）（Life Technologies，Gibco ，目录号：10091148）
青霉素链霉素（PS）（Life Technologies，Gibco ，目录号：15140-122）
抗SFTSV核蛋白（NP）抗体
注意：由我们研究所的抗体设备在兔中产生（Sun 等人
，2014），将抗体亲和纯化，1mg/工作浓度为5μg/ml。
TRIzol试剂（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：15596-026）
反转录酶M-MLV（RNase H）[Takara Biotechnology（大连），目录号：D2639A]
SYBR Premix Ex TaqTM完全实时[Takara Biotechnology（大连），目录号：DRR039A]
甲醇
4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）
Alexa Fluor 488山羊抗兔（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：A11008）
Hipure Plasmid Filter Midiprep Kit（Life Technologies，目录号：K210005）
维持细胞培养（参见配方）
感染细胞培养（见配方）
安装介质（参见配方）

设备

T25烧瓶（25cm 2）（BD，Falcon TM，目录号：353108）。
组织培养板，24孔平底（BD，Falcon，目录号：353047）或48孔板（BD，FalconTM，目录号：353078）
25厘米的瓶子
37℃，5％CO 2培养箱
7500快速实时PCR系统（Life Technologies，Applied Biosystems ）
Zeiss LSM510 Meta激光扫描共聚焦显微镜

程序

病毒隔离
1. 将Vero细胞接种在具有80％汇合的T25烧瓶中，在接种SFTSV患者血清之前一天在5ml DMEM/10％FBS/PS中培养。
  1. 血清从医院获得。通过医院的临床实验室从患者收集静脉血，并通过以2500rpm离心获得血清。
  2. 首先通过使用设计用于扩增SFTSV的NP的特异性引物的定量实时PCR来定量患者血清中的病毒（参见下文）。使用具有高SFTSV浓度（约10 8 s/ml）的血清来分离SFTSV。
  3. 将总共500μl的患者血清接种在25-cm瓶中的4.5ml DMEM/2％FBS中，在37℃，5％CO 2培养箱中孵育，并且用新鲜的DMEM/2％FBS。感染后24小时
2. 在病毒接种Vero细胞72小时后收集培养的上清液，并将上清液加入到T25瓶病毒中新接种的Vero细胞中。
  1. 所有收集的培养上清液用于前两至三代的病毒扩增，然后使用2.5ml上清液扩增病毒。
  2. 将病毒用培养的上清液扩增3至5代，直到NP的拷贝达到10 8到10 10/sup /μl。
  3. 将在DMEM/2％FBS/PS中的SFTSV病毒分配到1.5ml微量离心管中并储存在-80℃下，避免冻融循环，即使病毒对自由解冻过程不敏感。 >
3. 通过定量实时PCR测量的病毒滴定将上清液以3,000rpm离心5分钟。将200μl培养上清液加入1ml TRIzol试剂中。
  1. 使用TRIzol试剂根据制造商的说明书从上清液中分离总RNA。使用逆转录酶M-MLV（RNase H）按照用户手册在20μl反应中使用2μg总RNA合成cDNA。
  2. 接下来，根据制造商的说明书，使用来自每个样品的2μlcDNA用于使用SYBR Premix Ex Taq TM Perfect Real Time的定量实时PCR。设计引物（FW：AGCAGCTCAATTTGACTGAG，RW：TCATCTCCACCTGTCTCCTT）以扩增NP的87bp片段。
  3. 从病毒cDNA扩增全长NP DNA，并克隆到pCI-neo Vector;根据用户手册使用Hipure Plasmid Filter Midiprep Kit制备质粒
  4. 定量质粒的浓度，并根据它们的分子量计算DNA拷贝。将它们稀释成系列拷贝（10×10至10×10 7）作为标准曲线，之后进行定量实时PCR。
    20μlPCR反应包括：
    10μl2x SYBR Premix ExTaq
    10μM正向引物和反向引物各0.4μl 0.4μlROX Reference Dye II
    6.8μlH 2 O 2/b 2μlDNA样品
    在95℃10秒，95℃5秒和60℃30秒的40个重复循环进行PCR后，最终解离。
4. 病毒的滴定也可以通过用针对SFTSV的核蛋白（NP）的抗体进行免疫染色来测定。
  将Vero或HUVEC细胞接种在24孔板中，一天前80％汇合，并感染5代后收集的不同量的SFTSV（例如2μl，5μl，10μl，20μl至40μl在DMEM/2％ FBS）在37℃，5％CO 2培养箱中孵育2小时，在感染后2小时用PBS洗涤2次，并用DMEM/2％FBS改变。
  一天（24小时）感染后，用500μlPBS洗涤细胞一次，每次用PBS洗涤步骤孵育2-5分钟，然后将细胞用500μl100％甲醇在室温固定10分钟，然后用500μlPBS洗涤一次。
  接下来，将它们与200μl针对NP（在兔中产生）的抗体以5μl/ml在PBS/2％BSA中在37℃培养箱中孵育1小时。然后，用500μlPBS洗涤细胞三次。将细胞与2μg/ml Alexa Fluor缀合的山羊抗兔IgG在37℃孵育箱孵育1小时，然后用PBS洗涤3次。然后，用80μl封固剂包被细胞。使用4'，6-二脒基-2- 苯基吲哚（DAPI）。用荧光显微镜在10或20x透镜下捕获图像。
病毒感染体外
1. 根据实验，将Vero或其它细胞在一天前接种在24或48孔板上。这里，使用48孔板作为实例
2. 将从上清液收集的10μl病毒在200μlDMEM/2％FBS（MOI 1）中稀释并加入细胞中。
3. 将细胞在37℃，CO 2培养箱中孵育2小时后，用PBS洗涤细胞一次，然后用DMEM/2％FBS改变。
4. 为了测试SFTSV的感染，在14至24小时后，收集细胞培养物，使用TRIzol试剂制备总RNA，并如上所述进行定量实时PCR。或者，将细胞用甲醇固定并用如上所述的NP抗体染色

代表数据

图1.在10° ² 至10 ^{的SFTSV NP的定量实时PCR的标准曲线。。当进行定量PCR时，将质粒NP-pCI-neo从10稀释至10 ⁶。接下来，使用SYBR Premix Ex Taq按照用户手册在20μl反应中加入2μl，重复反应，并在7500快速实时PCR系统上进行PCR。 X轴是NP拷贝的数量。 Y轴是不同拷贝的PCR的CT值。样品拷贝将由程序根据标准曲线自动生成。右图是扩增图。

图2.用在Vero细胞（vero-105批次）中产生的SFTSV病毒感染HUVEC细胞。用不同量的病毒（2μl，5μl，10μl，20μl和40μl）感染的细胞），如图所示。用针对NP（绿色）的抗体对细胞染色，在封固介质（蓝色）中使用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）对核进行染色。使用Zeiss LSM510 Meta激光扫描共聚焦显微镜获得图像20次。}

笔记

当SFTSV感染不同的细胞时，当使用多个细胞时，根据实验需要选择用于RT-PCR或免疫染色的检测时间。这是因为细胞对SFTSV感染具有不同的敏感性。

食谱

维持细胞培养
DMEM/10％FBS/PS
感染细胞培养
DMEM/2％FBS/PS：1ml FBS，500μlPS和48.5ml DMEM，用于制备50ml DMEM/2％FBS/PS。
孵育条件
37℃5％CO 2培养箱
安装介质
1：1甘油：PBS
0.1％的没食子酸丙酯

致谢

我们感谢益源县中医医院的赵浩红为我们提供了来自SFTSV患者的血清样本。这项工作得到了中国科学技术部（2010CB530101,2011CB812501）和北京市政府的支持。

参考文献

Sun，Y.，Qi，Y.，Liu，C.，Gao，W.，Chen，P.，Fu，L.，Peng，B.，Wang，H.，Jing，Z.，Zhong，李，W.（2014）。非肌肉肌球蛋白重链IIA是促进早期感染伴有血小板减少症的严重发热的效率的关键因素综合征病毒。 J Virol 88（1）：237-248。