材料和试剂

PK裂解缓冲液
蛋白酶K（Sigma-Aldrich，目录号：P6556）
常用PCR试剂（例如Invitrogen PCR试剂盒 - Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：10342-020;或自制Taq和缓冲液）
限制酶（NEB）
琼脂糖凝胶
溴化乙锭（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：15585-011）
Plus DNA Ladder（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：10787-018）

设备

MJ Research PTC-200热循环仪（MJ Research）
薄壁PCR管（USA Scientific，目录号：1402-2700或1405-8100）

程序

用蛋白酶K消化分离基因组DNA 提示1。通常，制备大量的PK裂解缓冲液（对于配方，请参考秀丽隐杆线虫/DNA /单蠕虫PCR），补充蛋白酶K ，然后在-20℃下储存小等分试样（例如，1ml）。该强效酶在20μg/ml至100μg/ml的范围内工作良好，关键是在60℃下活化约1小时，然后在95℃下将其杀死约15分钟左右。你不想看到蛋白酶K在随后的PCR反应过程中折磨你的Taq酶提示2。我更喜欢选择合理的数字（例如，10）的妊娠成年动物，并将它们放入装有PK裂解缓冲液的PCR管中20μl）。它不伤害每个PCR反应使用超过1个蠕虫（〜1/2蠕虫的基因组DNA工作正好适合大多数强大的PCR基因分型）。对于PCR-RFLP，最好每个反应使用超过1个蠕虫（例如，5至10）。但是，在某些情况下，太多的DNA模板可能会抑制PCR反应

执行标准PCR，每个反应20μl。

设置PCR，通过在冰上按以下顺序添加以下组分到薄壁PCR管中：

无DNA酶的ddH 2 O 2/b	11.0微升
dNTP混合物（各10mM）	0.4μl（最终，每种200μM）
正向引物（10μM）	0.4μl（最终，每种0.2μM）
反向引物（10μM）	0.4μl（最终，每种0.2μM）
PCR缓冲液（10x）	2.0μl（最终，1x）
MgCl 2（50mM）	0.8μl（终浓度，2.0mM）
蠕虫裂解物（20μl）	2.0μl
Taq（5U /μl）	0.1μl（最终，每次反应0.5U）

运行PCR（当热块时将管放在块上）：

1个周期
94℃，3分钟

30个周期
94℃，10秒; 58℃，30秒; 72℃，30秒

1周
72℃，10分钟

用相应的酶消化，37℃，O/N。准备多重（N + 2）N反应：

ddH sub 2 O
2.5μl

10x缓冲区
2.5μl

酶（5U /μl至20U /μl）
0.2μl

等分5.0μl到每个PCR管中
在2.0％-2.5％琼脂糖凝胶上分析PCR产物的O/N消化对于 daf-2（1370）：
预期来自Nco I-消化物（NEB缓冲液3）的条带：野生型，202-bp;突变，234 bp 对于 daf-2（1368）：
预期来自Acl 1-消化物（NEB缓冲液4 + BSA）的条带：野生型，215-bp;突变，186 bp 提示3。由于产品尺寸之间的微小差异，建议长时间运行凝胶。总是添加具有已知基因型的野生型和突变体作为对照。溴化乙锭向阴极（ - ）迁移，正好与DNA迁移的方向相反。为了帮助随后在UV光下观察DNA，建议在阳极（+）附近的电泳缓冲液中加入几微升溴化乙锭（10mg/ml）。

代表数据

图1.这里显示了PCR基因分型的代表性数据。20μldaf-2（e1370）等位基因 - 基因分型PCR产物用Nco 我在37℃过夜。消化的DNA片段在2.0％琼脂糖凝胶上分离。 DNA条带的预期大小：野生型，202-bp; daf-2（e1370）突变，234-bp。泳道1：1Kb Plus DNA梯。泳道2,7,8：daf-2（e1370）^+/+ ; 泳道4,5：daf-2（e1370）^+/- ; 泳道3,6：daf-2（e1370）^-/- 。结果是高度可重复的，并且必须包括必要的控制以确保结果。

食谱

PK裂解缓冲液
10mM Tris-HCl（pH8.0） 50 mM KCl
2.5mM MgCl 2 v/v 0.45％Tween-20
0.05％明胶
20μg/ml蛋白酶K
准备并在-20°C下保存小份。

致谢

该协议改编自Kenyon实验室的成员（包括PZ）所进行的工作。 PZ由Larry Hillblom基金会的博士后研究金支持。

参考文献

Gems，D.，Sutton，A.J.，Sundermeyer，M.L.，Albert，P.S.，King，K.V.，Edgley，M.L.，Larsen，P.L.and Riddle，D.L。（1998）。两种多效性的daf-2突变类型影响幼虫的捕获，成人行为，生殖和长寿 > Caenorhabditis elegans 。 150（1）：129-155。
Neff，M.M.，Turk，E。和Kalishman，M。（2002）。用于单核苷酸多态性分析的基于网络的引物设计。趋势基因 18（12）：613-615。