材料和试剂

Pusillimonas noertemannii BS8（通过土壤富集隔离）
荧光假单胞菌 BS2（通过土壤富集分离）
聚-γ-D-谷氨酸> 250kDa [室内制备; 生产协议可以在Negus和Taylor（2014）中找到]
蛋白质测定染料试剂（Bio-Rad Laboratories，目录号：500-0006）
1.5ml微量离心管（Eppendorf，目录号：0030120086）
Laemmli样品缓冲液（Sigma-Aldrich，目录号：S3401-10VL）
IPG条（固定化pH 3-10,7cm）（Bio-Rad Laboratories，目录号：163-2000）
矿物油（Bio-Rad Laboratories，目录号：163-2129）
再水合盘（Bio-Rad Laboratories，目录号：165-4035）
丙烯酰胺溶液（Bio-Rad Laboratories，目录号161-0156）
TEMED（Sigma-Aldrich，目录号T9281）
琼脂糖覆盖溶液（Bio-Rad Laboratories，目录号163-2111）
Zymogram复性缓冲液（Bio-Rad Laboratories，目录号：161-0765）
Zymogram显影缓冲液（Bio-Rad Laboratories，目录号：161-0766）
分子生物学级水（Merck KGaA，目录号：H20MB05010）
30％乙醇
50％乙醇
最小盐培养基（见配方）
阴离子交换结合缓冲液（参见配方）
阴离子交换洗脱缓冲液（参见配方）
平衡缓冲液（参见配方）
非还原样品缓冲液（参见配方）
SDS缓冲液（参见配方）
解决凝胶缓冲液（参见配方）
堆叠凝胶缓冲液（参见配方）
10％SDS（见配方）
10％APS（参见配方）
10x TGE运行缓冲区（参见配方）
考马斯染料（参见配方）
考马斯脱色溶液（见配方）
亚甲蓝染料（见配方）
70％乙醇（见配方）

设备

通用管（Sterilin ，目录号：128B/P）
锥形瓶2L（Thermo Fisher Scientific，目录号：11577422）
比色杯（1.6ml半微量）（Thermo Fisher Scientific，目录号：10594175）
注射器驱动的过滤器（0.22μm，聚醚砜）（Millex ，目录号：SLGP033RS）
电极纸灯芯（Bio-Rad Laboratories，目录号：165-4071）
摇匀培养箱（Infors AG，型号：Multitron标准）
分光光度计（PerkinElmer，型号：Lambda 25）
台式离心机（Sigma-Aldrich，型号：4-16K）
超声波仪（MSE，型号：Soniprep 150）
指数声波探测器（MSE，目录号：38121-114A）
离心蛋白浓缩器（Sartorious，型号：Vivaspin 20,3kDa MWCO，目录号：VS2092）
离心蛋白浓缩器（Sartorious，型号：Vivaspin 6,3kDa MWCO，目录号：VS0692）
静态培养箱（单位，停止）（B& T）
ÄKTAprimeplus色谱系统（GE Healthcare，Prime plus，目录号：11-0013-13）
阴离子交换色谱柱（GE Healthcare，型号：Hi-Trap Q XL，目录号：17-5158-01）
轨道摇摆平台（Stuart，型号：SSM1）
热循环仪（TECHNE，停产，型号：FTGENE 2D）
电泳细胞（Bio-Rad Laboratories，Mini-PROTEAN Tetra Cell，目录号：165-8003）
等电聚焦电池（Bio-Rad Laboratories，Protean，目录号：165-4000）
涡旋混合器（Appleton Woods，Clifton cyclone，目录号：AA6500）

程序

通过快速解冻含有1ml产生解聚酶的聚生体培养物的冷冻小瓶，并在30ml通用管中以1:100的稀释度接种到10ml最小盐培养基（MSM）肉汤中来制备过夜培养物。将接种的培养物在28℃下轨道振荡（120rpm）孵育16小时
将过夜培养物以1:100的稀释度接种在2L锥形瓶中的500ml MSM肉汤中，并在28℃下进行轨道振荡（120rpm）孵育。
通过将1ml等分试样转移至比色杯并在分光光度计中读数直至OD 600达到0.5来获取光密度读数（OD 600）。
通过在4℃下以10,000×g离心30分钟使细胞沉淀。将细胞沉淀重悬于10ml蒸馏水中，并通过使用指数探针在冰上超声处理破碎细胞（4×30秒爆发，振幅为15μm，间隔30秒）。
通过在4℃下以13,000xg离心10分钟除去细胞碎片，并使上清液通过注射器驱动的过滤器（0.22μm孔径）以除去任何剩余的全细胞。
将含有细胞内蛋白质的滤液浓缩约30倍，并通过在Vivaspin 20蛋白质浓缩器（3kDa MWCO）中离心（5000×g）在4℃下与阴离子交换结合缓冲液进行缓冲液交换，。
通过使用BSA标准品以1mg/ml，0.5mg/ml，0.25mg/ml和0.125mg/ml的浓度产生标准曲线来确定样品的蛋白质浓度。将蛋白质标准品或样品的等分试样（20μl）与1ml蛋白质测定染料在小杯中合并，一式两份，并根据制造商的说明在分光光度计中在OD 595处读取。使用标准曲线通过用线性回归绘制最佳拟合线来计算样品的浓度
用阴离子交换结合缓冲液将样品的浓度调节至2mg/ml，用于阴离子交换层析。
将1ml Hi-Trap Q XL柱连接到ÄKTAprimeplus快速蛋白液相色谱系统，并以1ml/min的流速用5个柱体积的阴离子交换结合缓冲液平衡，然后用5个柱体积的阴离子交换洗脱缓冲液，最后加入10倍柱体积的阴离子交换结合缓冲液
在阴离子交换结合缓冲液中的细胞内蛋白质（10mg）通过系统的注射端口以5ml /分的总体积以1ml/min的流速加入而结合到平衡的柱上。
结合的蛋白质用在阴离子交换洗脱缓冲液中的0-1M的NaCl线性梯度洗脱，流速为1ml/min。使用ÄKTAprime菜单中的"离子交换"应用程序模板时，将自动创建线性渐变。然后将梯度保持在NaCl浓度为1M，体积为17ml，以确保所有结合的蛋白质被洗脱
在NaCl梯度的持续时间内将洗脱级分（1ml /级分）收集在1.5ml微量离心管中，通过在280nm吸收监测色谱。
将单个1ml级分浓缩约10倍，并通过在Vivaspin 6蛋白质浓缩器中离心（5000×g）在4℃下与PBS进行缓冲液交换。如步骤7所述测定浓缩级分的蛋白质浓度
通过与PDGA温育和通过SDS-PAGE分析聚合物降解产物来检查浓缩级分的解聚酶活性。反应混合物（20μl）含有8μgPDGA，0.5μg蛋白质和PBS至体积。将反应物在37℃下在静态培养箱中孵育16小时，并通过与等体积的2×Laemmli样品缓冲液合并终止，在95℃下在热循环仪中加热10分钟。通过SDS-PAGE检查PDGA降解产物
使用具有1mm凝胶厚度的Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra Cell系统，使用以下配方制备丙烯酰胺凝胶：

*溶解凝胶缓冲液：1.5M Tris-HCl（pH8.8）
堆叠胶缓冲液：0.5M Tris-HCl（pH 6.8）
将反应混合物样品（20μl）加载到凝胶中，并在150V在SDS缓冲液中电泳直到溴酚蓝染料到达凝胶底部。
降解产物通过用亚甲基蓝染色凝胶15分钟，在轨道摇摆平台上轻轻搅拌来显现。凝胶在30％v/v乙醇（15分钟）30％v/v乙醇（15分钟）中脱色，然后几次更换蒸馏水，直到除去背景（参见图1的代表性结果）。

图1.通过阴离子交换层析分离的单个级分的解聚酶活性。通过阴离子交换层析分离的来自浓缩的单个级分的蛋白质（0.5μg）与PDGA（8μg）在37℃下孵育16小时在20μl反应中。降解产物通过用亚甲基蓝染色的SDS-PAGE显现
合并显示解聚酶活性的级分，并在Vivaspin 6蛋白质浓缩器中通过离心（5000×g）在4℃浓缩约30倍。如步骤7所述测定合并的材料的蛋白质浓度
为了检测具有解聚酶活性的蛋白质，使用2D-酶谱。用PBS将部分纯化的解聚酶制剂（合并的和浓缩的级分）的蛋白质浓度调节至2mg/ml，将含有20μg总蛋白质的等分试样与105μl非还原性样品缓冲液合并。通过涡旋剧烈地混合样品，并用移液管立即施加到用于等电聚焦的再水化托盘中的7cm IPG条（pH 3-10）。
为了防止样品蒸发，使用矿物油（约1ml）覆盖条。用盖子覆盖再水化托盘，并且将条留在室温下吸收样品过夜
电极纸灯芯用8μl分子生物学级水润湿并定位在聚焦托盘的电极上
用一对镊子从再水化托盘中取出IPG条，置于干燥的薄纸上，凝胶面朝上并用湿纸巾覆盖30秒，以从条表面除去任何过量的矿物油。 br />
然后将IPG条带定位在聚焦托盘上，凝胶侧面朝下。将约2ml矿物油层叠在IPG条上，完全覆盖它们以防止样品在聚焦期间蒸发
聚焦托盘位于PROTEAN IEF单元中，盖子关闭。然后使用以下条件使条带聚焦：
调节步骤：250 V 15分钟，快速斜坡
线性斜坡：250 V，达到4,000 V，持续2 h
最终聚焦：10 kVh时为4,000 V
保持步长：无限期为500伏
N.B：聚焦电池的温度保持在20℃ 最大电流：50μA/IPG条
在聚焦步骤完成后立即从盘中取出条带，并转移到干燥的薄纸上，凝胶面朝上。通过用湿纸巾覆盖条带30秒，从凝胶表面除去过量的矿物油。然后将IPG条转移至干净的再水化托盘，凝胶侧朝上以达到平衡，然后在第二维上聚焦。
IPG条用2ml平衡缓冲液覆盖并在定轨振荡器上轻轻搅拌15分钟，缓冲液倾析。
使用镊子从平衡盘中取出IPG条，并置于IPG孔中与终浓度为0.05％w/v的PDGA共聚的10％丙烯酰胺凝胶上。如步骤15所述制备凝胶，向凝胶混合物中加入冷冻干燥的PDGA。
将琼脂糖覆盖溶液分层到IPG孔中以将IPG条固定在适当位置，并使其在室温下固化。将凝胶置于装有TGE运行缓冲液的Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra细胞池中，并在125V电泳，直到溴酚蓝染料到达凝胶底部。
电泳后，用基于考马斯的染料染色重复的凝胶以观察蛋白质斑点或通过酶谱法分析。
对于蛋白质斑点的可视化，用考马斯染料在摇摆平台上温和搅拌覆盖凝胶1小时。
倾析污渍，并在摇摆平台上用几个变化的脱色溶液洗涤凝胶，直到背景被除去。
作为酶谱形成的凝胶在Bio-Rad酶谱复性缓冲液中在室温下温和搅拌孵育30分钟。
倾析缓冲液，并在室温下在Bio-Rad酶谱显影缓冲液中平衡凝胶30分钟，同时温和搅拌。
在新鲜的Bio-Rad酶谱显影缓冲液中在37℃下进行最终温育16小时。
用蒸馏水洗涤凝胶，并染色以检测用亚甲基蓝共聚的PDGA的显影15分钟
然后将凝胶在30％v/v乙醇（15分钟），50％v/v乙醇（15分钟）中脱色，随后用几次蒸馏水改变。
解聚酶活性区域被鉴定为针对黑色背景的澄清斑点，其中酶已经水解共聚的PDGA底物（参见图2的代表性结果）。

图2.在非还原条件下，在含有共聚的0.05％PDGA的凝胶中对显示解聚酶活性的合并级分（20μg蛋白质）进行2D电泳和2D-酶谱。在酶谱中，解聚酶活性表现为对黑暗背景的亮点（白色箭头）;考马斯蓝染色凝胶上的相应蛋白斑点由黑色箭头表示

食谱

最小盐培养基
4.3克K sub 2 HPO 4 <
3.4g KH 2 PO 4 sub/
2.0g（NH 4）2 SO 4 4
0.34g MgCl 2 6H 2 O
0.026g CaCl 2 。 2H 2 0.2％w/v PDGA
蒸馏H 2 O至1000ml，通过高压灭菌
灭菌
阴离子交换结合缓冲液
20mM Tris-HCl
用HCl
调节pH至9.0
阴离子交换洗脱缓冲液
1 M NaCl
20mM Tris-HCl
用HCl
调节至pH 9.0
平衡缓冲器
2％SDS
0.05 M Tris-HCl（pH 8.8）
30％甘油补足100毫升dH 2 O
非还原样本缓冲区
4 M尿素
4％CHAPS
0.2％载体两性电解质 0.002％溴酚蓝
SDS缓冲区
2％SDS
0.05M Tris-HCl
30％甘油用HCl
调节pH至8.8
解决凝胶缓冲液
1.5M Tris-HCl
用HCl
调节pH至8.8
堆叠凝胶缓冲液
0.5M Tris-HCl
用HCl
调节pH至6.8
10％SDS
10克SDS
蒸馏H 2 O至1L
10％APS
100 mg APS
1ml蒸馏的H 2 O 2 /
10x TGE运行缓冲区
30.0g Tris-HCl
144.0g甘氨酸
10.0克SDS
用蒸馏H 2 O蒸气将体积调节至1000ml
考马斯染料
1克考马斯亮蓝色
500 ml甲醇
100ml冰乙酸蒸馏H 2 O至1000ml
考马斯脱色溶液
100ml冰乙酸 200 ml甲醇
蒸馏H 2 O至1000ml
亚甲蓝染料
2g亚甲蓝
0.01克KOH / 220 ml乙醇蒸馏H 2 O至1000ml
70％乙醇
700 ml乙醇蒸馏出300毫升

致谢

这项工作得到了医学研究委员会能力建设学生奖。

参考文献

Negus，D.和Taylor，P.W。（2014）。一种聚-γ-（D） - 谷氨酸解聚酶，炭疽芽孢杆菌。 Mol Microbiol 91（6）：1136-1147。