材料和试剂

集胞藻 PCC 6803野生型（WT）菌株[参见Schwarzkopf et al。（2014）了解详情]
抗生素
1. 氯霉素（Merck KGaA，目录号：2366）
2. 卡那霉素硫酸盐（Carl Roth，目录号：T832.1）
3. 壮观霉素（Duchefa Biochemie，目录号：S 0188.0025）
植物琼脂（Duchefa Biochemie，目录号：P1003.1000）
NaNO 3（Carl Roth，目录号：8601.2）
HPO 4（Carl Roth，目录号：P749.2）
MgSO 4·7H 2 O（Carl Roth，目录号：P027.2）
CaCl 2 2（Sigma-Aldrich，目录号：223506）。
柠檬酸（Carl Roth，目录号：1818.1）
柠檬酸铁铵（III ）（Carl Roth，目录号：CN77.1）
EDTA Na 2（Carl Roth，目录号：8043.2）
Na 2 CO 3（Sigma-Aldrich，目录号：S-1641）
（Carl Roth，目录号：6943.3）
（Sigma-Aldrich，目录号：M3634）。
ZnSO 4·7H 2 O（Merck KGaA，目录号：0143532）
5（Carl Roth，目录号：0274.3）
（Carl Roth，目录号：P025.1）
（Merck KGaA，目录号：A834336548），br（NO 3）2 sub。 />
（Merck KGaA，Ltd。），其包含一种或多种选自以下的化合物：Na 2 O 3，Na 2 O 3，目录号：K5023616）
BG11介质（见配方）
BG11琼脂平板（见配方）
使用的常见抗生素（参见配方）

设备

培养皿（Greiner Bio-one，目录号：632180）
2ml反应管（Eppendorf）
胶带（Gotha-VLIES，10m×1.25cm）（Gothaplast，目录号：PZN-7105417）
离心机（Eppendorf，型号：5810R）
使用照明摇动培养箱（Sartorius，型号：Certomat BS-T）
带有灯泡的轻型货架（NARVA LT 36W/760-010日光）（Brand-Erbisdorf）
光度计（Pharmacia LKB-Ultrospec III）
流动柜（Heraeus，HERAsafe，型号：HS12）

程序

所有对集胞藻细胞的处理在流动箱中进行。在整个过程中，无菌工作条件至关重要。
将集胞藻细胞在28℃下在连续照射（20μmol/m 2 s/s）下维持在BG11琼脂板上，并以2周的间隔重新划线。
为了产生分批培养物，用一个接种环的集胞藻细胞接种25ml液体BG11培养基（在100ml-玻璃烧杯中），并使细胞生长至光密度（OD 750在28℃下在20μmol/m 2的光强度的连续照明下的中等指数生长（中指数生长）和持续的搅拌（150rpm）。取决于接种密度，需要几天至约一周以达到0.5至0.8的指示OD 750值。
将10ml细胞培养物离心（5分钟，28℃，1×10 7×g），将细胞沉淀重悬于5ml BG11培养基中，并均匀分布于5个无菌的2ml反应管中。
加入DNA（3至5μg环状质粒DNA），通过轻拍轻轻混合细胞，并在黑暗中在28℃下温育过夜。为了测量存活率和自发突变频率，留下一个等分试样，没有质粒DNA，并在黑暗中在28℃下温育过夜。
在黑暗孵育后，将200μl细胞培养物接种在缺乏抗生素的BG11琼脂平板（94×16mm，参见"材料"）上，并在连续光中以20μmol//sup>/s
在恒定光照下培养2天后，向琼脂平板中加入浓度为15μg/ml的抗生素。因此，用无菌刮刀提起琼脂，并将1ml适当的抗生素溶液施加到培养皿的底部（图1）。在必须应用几种不同的抗生素的情况下，制备含有在1ml总体积中组合的每种抗生素的抗生素混合物。
用胶带密封板，以避免干燥，并在28℃下在20μmol/m 2的光强度的连续照明下进一步温育。 2至3周后出现菌落。
为了实现完全分离，挑取单个菌落，并在含有合适抗生素的BG11平板上划线（参见步骤10，获得合适的抗生素浓度）。当细胞长出（约一至两周）时，将细胞再次在含有合适抗生素的新BG11平板上划线。将该连续条纹纯化重复至少四轮（总共）以确保分离。
为了检查构建体的阳性基因组整合，对基因组DNA进行PCR。可能发生即使在几轮连续条纹纯化后也不能实现完全分离。当尝试基因敲除基因时，这可能发生，该基因对于细胞的活力是不可缺少的。在这种情况下，可以应用反义方法或显性负面形式的过表达以干扰目标基因的功能。
在连续照射（20μmol/m 2/s/s ）下，将阳性克隆保持在含有适当抗生素的BG11琼脂平板上，并以2周的间隔重新划线。使用常用抗生素是8μg/ml的氯霉素，10μg/ml的壮观霉素，10μg/ml的卡那霉素。

图1.在琼脂层下施加抗生素。使用无菌弯曲刮刀提起琼脂层，并将抗生素溶液施加到培养皿的底部。

笔记

转化效率可以变化，这取决于细胞状态和用于转化的构建体，并且通常每种方法导致10至50个克隆。

食谱

BG11培养基（Stanman等人，1971）
BG11培养基以10x浓度制备，在121℃高压灭菌12分钟并储存在4℃。在使用前，将890ml H 2 Odest，100ml 10×BG11和10ml痕量金属溶液合并，得到1L 1×BG11。将BG11培养基等分到培养容器中，高压灭菌并在4℃贮存 10x BG11介质：
NaNO <3> 15g
HP 0.4g
MgSO 4·7H 2 O 7·7H 2 O 0.75·g / CaCl 2 2 H sub 2 O 0.36 g
柠檬酸0.06 g
柠檬酸铁铵（III +）0.06g
EDTA Na 2 0.01g/g Na 2 CO 3 sub 3 0.2g
添加H ₂ Odest 1 L
高压灭菌并在4°C下贮存
每升痕量金属溶液：

MnCl 2 ^{4 H 2 O 1.81g
ZnSO 4 sub} 7 H sub 2 O 0.22 g
Na MoO 4 H 0.5 H 2 O 0.39g
CuSO 4 H 5 H 2 O 0.08g/dm 2 Co（NO 3）2.6 H 2 O 0.05g/m 2
BG11琼脂平板上对于固体培养基1，BG11补充有1.5％（w/v）植物琼脂，0.18％（w/v）硫代硫酸钠（Na 2 S 2 Sub 2 O）加入以更好地凝固琼脂），高压灭菌并倒入陪替氏培养皿（每个培养皿约30ml）中。适当时，将过滤灭菌的抗生素加入培养基中
使用常用抗生素
氯霉素8μg/ml
10μg/ml的壮观霉素
卡那霉素10μg/ml

致谢

稳定转化集胞藻由Grigorieva和Shestakov（1982）报道。实验工作由慕尼黑理工大学（TUM）核心资助。

参考文献

Desai，S. H.和Atsumi，S。（2013）。光合作用的化学生物技术。 Opin Biotechnol 24 （6）：1031-1036。
Grigorieva，G。和Shestakov，S。（1982）。转换在蓝细菌集胞藻 FEMS Microbiol Lett 13（4）：367-370。
Schwarzkopf，M.，Yoo，Y. C.，Huckelhoven，R.，Park，Y.M.and Proels，R.K。（2014）。蓝藻植物色素2调节异养代谢，并在热和高光应激反应中具有功能。/a> Plant Physiol 164（4）：2157-2166。
Stanier，R.Y.，Kunisawa，R.，Mandel，M。和Cohen-Bazire，G。（1971）。单细胞蓝绿藻的纯化和性质细菌学杂志35（2）：171-205。