材料和试剂

细菌培养基（根据所研究的细菌的需要;对于大肠杆菌，Luria Broth或DMEM是合适的）
Tris碱（Thermo Fisher Scientific）
Triton X-100（Sigma-Aldrich）（可选）
Tris-Triton（TT）
HCl（盐酸）
TT（见配方）

设备

台式超速离心机（例如Beckman Coulter，型号：TL-100），对于25ml或更少的培养物体积能够达到50,000rpm，并且较大的主机超速离心机用于更大的培养物体积制备物
台式离心机，最高可达12,225×g
超声波仪
分光光度计

程序

细菌应在适于所研究的细菌种类或正在测试的环境条件的培养基中培养。培养物可以是对数或固定相，虽然固定相培养物可能更难溶解用于蛋白质提取。
通过在4℃下以6,708×g离心10分钟收获细菌，丢弃培养物上清液（除非需要分析分泌的蛋白质谱）。
通过用缓冲液将其均匀地重悬浮至体积为颗粒的50倍的体积（例如，来自200ml静止期大肠杆菌培养物的沉淀物）来洗涤沉淀物体积约2ml，并且将需要至少100ml缓冲液），然后在6,708×g下在4℃下再离心10分钟。重复此洗涤步骤。
用于分离。大肠杆菌膜蛋白，沉淀应在10mM Tris碱（pH7.5）（该缓冲液可与来自任何细胞来源的任何蛋白质一起使用）中洗涤。对于小体积培养物蛋白质分级分离（例如25ml），过夜生长将给出约2的OD 600;一旦收获并洗涤，将其重悬于0.5-1ml 10mM Tris碱（pH7.5）中，得到OD 600为20-30的最终细胞密度（悬浮液应具有外观的浇注膏）。对于大体积培养（例如200ml），重悬于5-10ml 10mM Tris碱（pH7.5）中。如果蛋白水解可能是一个问题，广谱蛋白酶抑制剂的混合物应包括在制造商推荐的水平。
在-80℃下将培养物悬浮液冷冻2小时或过夜以削弱细胞壁并通过超声处理增加细菌细胞的裂解。
将细菌悬浮液在冰上解冻，并将其放置在置于冰水浴中的不可破碎的塑料烧杯中。将超声波仪设置在6-8微米之间，并且在15秒超声处理的循环中裂解细胞，然后冷却45秒，直到裂解物从不透明溶液变成较少混浊的溶液（通常4-5个循环足以用于对数期细胞;静止相培养可能需要更多的治疗）。
将裂解的样品在6,708×g离心10分钟，以除去大的碎片碎片和未裂解的细胞（这些将包含在沉淀中），并转移含有总蛋白提取物的上清液（膜和细胞质）到合适的超速离心管中。
在4℃下在108,726×g超速离心蛋白质提取物10分钟，以从细胞质蛋白质中分离膜蛋白质。
离心后，上清液含有胞质蛋白，而沉淀含有总膜蛋白。如果仅需要总膜蛋白部分（包含内膜蛋白和外膜蛋白），则转到步骤11，如果仅需要外膜和内膜蛋白部分，则进行步骤11，然后进行10。
将由总膜蛋白组成的沉淀重新悬浮于补充有10mM Tris-HCl（pH 7.5）（TT;例如）的2％Triton X-100的10mM Tris-HCl对于最初为25ml的小体积培养物，在100-200μl的TT中重悬）;通过在室温下温育偶尔混合30分钟使内膜蛋白溶解。然后将混合物在4℃下再次在108,726×g离心10分钟;上清液将含有内膜蛋白部分，而不溶性沉淀物将含有外膜蛋白。为了除去任何残留的内膜蛋白，将外膜沉淀在500μlTT中再提取30分钟（该步骤仅用于纯化外膜蛋白，因此上清液应当被丢弃）。
注意：需要额外的洗涤/提取步骤来提高不同级分的相对纯度。有时，在馏分之间可能存在，特别是如果人们不注意在离心之间去除所有上清液（但是这更多是程序错误）。通常，我们确定两次洗涤足以获得纯膜级分。我们通过在SDS凝胶上分离蛋白质级分并对蛋白质进行测序来测试蛋白质级分的纯度。但是，如果需要，可以增加更多的洗涤步骤以提高纯度。
在10mM Tris-HCl（pH 7.5）中洗涤总膜沉淀两次或外膜沉淀一次;对于最初为25ml的小体积培养物，500μl缓冲液就足够了。最后，根据膜沉淀大小重悬于30-50μl相同的缓冲液中
细胞质和膜蛋白样品的浓度应使用Bradford测定法（He，2011a）或通过设定在280nm的分光光度计测量。
对于储存，蛋白质应该包含在1.5或2毫升无菌塑料管中，并在-20°C下储存大约1个月或-80°C 6个月或更长时间。蛋白质提取物应在冰上解冻，并始终保持在0-4°C最少的时间，以最大限度地提高稳定性和蛋白质活性。
对于简单的1维SDS PAGE，将标准化的蛋白质样品与足量的2x SDS蛋白质样品缓冲液混合，并如He（2011b）（用于1D SDS-凝胶电泳）所述进行凝胶电泳。如果需要，蛋白质级分也可以通过2D凝胶电泳分离

食谱

TT
20μlTriton X-100的0.98ml 10mM Tris-HCl（pH7.5）中

致谢

该协议来自Haigh等人（2013）。

参考文献

他，F.（2011a）。 Bradford蛋白测定生物协议 1（6）：e45。
他，F.（2011b）。 Laemmli-SDS-PAGE。生物协议 1（11）： e80。
Haigh，R.，Kumar，B.，Sandrini，S。和Freestone，P。（2013）。突变设计和菌株背景会影响大肠杆菌的表型 luxS 突变体。 Mol Microbiol 88（5）：951-969。