材料和试剂

将8-10周龄小鼠C57BL/6J野生型小鼠（Charles River Laboratories International，http://www.criver.com）和mdx-4cv小鼠（B6Ros.Cg-Dmdmdx-4cv/J，在C57/BL/6 background; Jackson ImmunoResearch Laboratories）
注意：根据欧洲共同体指南并经机构伦理委员会批准，对动物进行治疗。
胶原酶II（Worthington Biochemical，目录号：CLSS2）
Dulbecco改良的高葡萄糖Eagle培养基（DMEM高葡萄糖）（EuroClone，目录号：ECB7501L）
100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素（EuroClone）
L-谷氨酸（EuroClone）
重组人碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF）（Pepro Tech，目录号：100-18B）
生长因子减少的BD Matrigel Matrix（BD Biosciences，目录号：356230）
胎牛血清（FBS）（EuroClone）
无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）w/o Ca ++ ++ Mg ⁺⁺（EuroClone）
抗体
1. 抗CD31-藻红蛋白/Cy7（抗CD31-PE/Cy7，克隆390）（eBioscience，目录号：25-0311）
2. 抗CD45-PECy7（克隆30-F11）（eBioscience，目录号：15-0451）
3. 抗SM/C2.6-生物素（由Fukada博士友情提供）（Fukada等人，2004）
4. 链霉亲和素-PE（BioLegend）
5. 抗α7整联蛋白-PE（克隆R2F2）（AbLab Laboratorio di Istologia e Citologia Patologica Veterinaria，目录号：AB10RS24MW215）
6. 抗PDGFRα-别藻蓝蛋白（APC，CD140a，clone APA5）（BioLegend，目录号：135907）
7. 抗LY-6A/E SCA-1-别藻蓝蛋白/Cy7（APC/Cy7，克隆B7）（BD Biosciences，目录号：560654）
8. 7-氨基放线菌素D（7-AAD）（Life Technologies，目录号：A1310）
生长培养基（GM）（参见配方）
洗涤缓冲液（WB）（参见配方）
胶原酶II溶液（参见配方）
红细胞裂解缓冲液（见配方）
注意：使用1ml这种溶液约1克肌肉。
排序缓冲区（请参阅配方）
Matrigel解决方案（参见配方）
b-FGF溶液（见配方）

设备

剪刀和镊子
细胞培养塑料盘（Corning，Costar ）
六个多井（Corning，Costar ^®）
离心机
50和15 ml塑料管
18G-10ml注射器
70μm和40μm细胞过滤帽（BD Biosciences）
Beckam Coulter细胞分选仪MoFlo TM TM/XDP（Beckman Coulter，目录号：ML99030）
在37℃和5％CO 2/s的细胞培养箱中培养
显微镜或细胞计数器

程序

通过递送递增浓度的CO 2并除去后肢肌肉来牺牲小鼠（C57BL/6或MDX）。
称量肌肉质量。
将它们放在含有冷PBS的培养皿中。
去除可见的腱，脂肪组织和血管
使用弯曲的尖端剪刀将新培养皿（不含PBS）上的肌肉剁碎几分钟，直到组织表现为糊状。
将组织转移到50ml塑料管中，并添加0.2％胶原酶II在DMEM（无血清）。使用体积为2-4ml胶原酶对于1g肌肉重量：通常每只小鼠允许获得1-1.5g组织。将塑料管放入振荡恒温槽中，在37℃下1小时。
通过在500rpm离心从消化的材料中分离未消化的。所有离心均在室温下进行。除去上清液（消化的材料），用室温PBS（约50ml PBS/1g肌肉）稀释并通过18G-10ml注射器以产生单细胞悬浮液（通过针约10次传代）。
加入到未消化的肌肉新鲜胶原酶溶液（使用相同体积的步骤6），并置于振荡恒温浴中，在37℃另外30分钟。然后，重复步骤7.丢弃在第二次离心程序后可能残留的最终未消化的物质
通过两个消化获得的肌肉浆液通过70μm细胞滤器帽并随后通过40μm细胞滤器帽过滤，使用50ml注射器和50ml塑料管。
在2,000 rpm离心10分钟，并使用移液管去除上清液。
通过用1-2ml红细胞裂解缓冲液重悬细胞来消除血红细胞
通过加入50ml含有2％FBS的PBS稀释红细胞裂解缓冲液，并在室温下以2,000rpm离心10分钟。
除去上清液后，用移液管加入1ml含有10％FBS的PBS并计数细胞
离心管2000 rpm离心10分钟，孵育回收的细胞30分钟与抗SM/C2.6-生物素冰上。在100μl含有2％FBS的PBS中使用1μl抗体用于1×10 6个细胞。
加入1ml洗涤缓冲液，并以2,000rpm离心5分钟
除去上清液后，用链霉抗生物素-PE和其它标记抗体[抗CD31-PECy7和抗CD45-PECy7，抗α7-整联蛋白-PE（对于MDX小鼠），抗PDGFRα -APC，抗LY-6A/E SCA-1-APC/Cy7]和与7-氨基放线菌素D一样。如在步骤14中，在100μl中使用1μl抗体用于1×10 6个细胞μl含有2％FBS的PBS。
加入50ml洗涤缓冲液，并以2,000rpm离心5分钟
除去上清液后，加入2ml分选缓冲液/小鼠
为了建立仪器，将约50-100,000个细胞的样品与各单个抗体或用7-氨基放线菌素（单染色补偿）在相同条件的样品中平行分别染色。 50-100,000个细胞的样品也没有与任何抗体孵育（未染色的对照）。 30分钟后，加入1ml洗涤缓冲液，然后离心（2,000rpm，5分钟）。除去上清液，加入200-300μl含2％FBS的PBS。
对于细胞分选机设置：使用未染色的对照，通过前向散射和侧向散射排除碎片和死细胞并设置基础荧光（图1A）。然后进行7-AAD门控，使用用7- 氨基放线菌素（门1,7AAD阴性细胞和门2），以进一步消除死亡
使用单独用每种抗体染色的样品补偿荧光，然后在样品中选择以将CD34细胞分选为CD45 -/sup/CD31 -/- >（门3）/smc2.6 ^{（门4）/SCA-1 ⁺和PDGFRα⁺（门5）细胞。为了提高纯度，我们优选对WT小鼠使用抗smc2.6，对于mdx 小鼠使用抗α7整联蛋白。}
在分选结束时，在预先用Matrigel包被的多孔平板中以1×10 4个细胞/cm 2的平板FAP细胞在生长培养基中加上b- FGF在潮湿培养箱（37℃和5％CO 2）中培养

代表数据

图1.细胞分选程序程序。一个。单细胞门控; B.基于选择7ADD阴性细胞（1，左）和前向散射/侧向散射参数（2，右）选择的活细胞; CD31和CD45阴性细胞门控（3）; D.α7整联蛋白门控（4）; E.卫星细胞门控（Sca 1 /来自α7-整合素阳性门的PDGFRα阴性细胞）; FAP细胞注射（ScA 1 /PDGFRα阳性细胞来自α7-整合素阴性门（5）。

笔记

FAP细胞回收范围为总细胞的1至3％。消化似乎是关键点。

食谱

生长培养基（GM）
补充有热灭活的20％胎牛血清（FBS），100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素和5ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子的Dulbecco改良的高葡萄糖Eagle培养基（DMEM）
洗涤缓冲液（WB）
PBS w/o Ca ⁺⁺和Mg ⁺⁺，加热灭活2％FBS。
胶原酶II溶液
在DMEM中制备0.2％胶原酶溶液，在0.2μm过滤器上过滤并立即使用
红细胞裂解缓冲液
0.8％NH 4 Cl的Tris缓冲液（pH 8）中
排序缓冲区
PBS w/o Ca 2+ 2 + 和Mg 2+ 2+ 与5％热灭活的FBS接触。
Matrigel解决方案
在DMEM中稀释Matrigel 1：100，并在制备板涂料后立即使用
将左Matrigel工作溶液倒入板中30分钟，然后取出
Matrigel不能干燥
b-FGF溶液
准备100微克/毫升储备溶液等分试样，并保持在20℃
在培养物中，b-FGF浓度为5ng/ml 除霜后，b-FGF等分试样可保持在4℃，并在一周内使用

致谢

我们感谢Suk/Fukada教授（大阪大学，大阪，日本）的SMC/2.6抗体。这项工作得到了欧洲共同体框架计划FP7/2007-2013（授权协议n°241440），意大利卫生部RC 2013，意大利Ricerca sul Cancro（AIRC IG11362）和Ricerca大学部长 PRIN 2010-2011。

参考文献

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Fukada，S.，Higuchi，S.，Segawa，M.，Koda，K.，Yamamoto，Y.，Tsujikawa，K.，Kohama，Y.，Uezumi，A.，Imamura，M.，Miyagoe-Suzuki，Y 。，Takeda，S。和Yamamoto，H。（2004）。通过新型单克隆抗体从鼠骨骼肌的静止卫星细胞的纯化和细胞表面标记物表征。 Exp Cell Res 296（2）：245-255。
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