材料和试剂

从蛋白质纯化核酸
1. 在纯化缓冲液中纯化的蛋白质和共纯化的核酸（例如 Tt Ago与siDNA指南）
  注意：请参阅协议"表达和纯化嗜热栖热菌Argonaute蛋白"（Swarts等人，2014b）。
2. 蛋白酶K溶液（20mg/ml）（Life Technologies，Ambion ，目录号：AM2548）
3. CaCl 2溶液（50μM）
4. Roti苯酚/氯仿/异戊醇（pH 7.5-8.0）（Carl Roth，目录号：A156）
5. 99％乙醇
6. 70％乙醇（预冷至-20℃）
7. 线性丙烯酰胺（5mg/ml）（Life Technologies，Ambion ，目录号：AM9520）
  注意：或者，可以使用自制的线性丙烯酰胺（ http://www.uvm.edu/~tpdelane/lab/protocols/LinearPolyAcryl.htm ）。
8. RNase游离MQ水
9. 分析纯化核酸所需的其他材料和试剂（可选）
  1. T4多核苷酸激酶（PNK）（New England Biolabs，目录号M0201）
  2. T4多核苷酸激酶反应缓冲液（New England Biolabs，目录号M0201）
富集和准备ssDNA分子进行测序
1. 在MQ水中纯化的单链DNA核苷酸（例如参见程序部分A"从蛋白质纯化核酸"）
2. RNA酶A（DNase和无蛋白酶）（10mg/ml）（Thermo Fisher Scientific，目录号：EN0531）
3. 末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）（重组体）（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：10533-073）
4. 末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）缓冲液（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：16314-015）
5. dATP（100mM）（Thermo Fisher Scientific，目录号：R0141）
6. QIAquick核苷酸去除试剂盒（QIAGEN，目录号：28304）
7. 引物A（5'-GAGAGAGGATCCCGAATTGTGCAGCTGTCAATCAACC-3'）（5μM）
8. T4 RNA连接酶1（New England BioLabs，目录号：M0204）
9. T4 RNA连接酶反应缓冲液（10×，用T4 RNA连接酶1提供）
10. ATP（10mM）（用T4 RNA连接酶1提供）
11. PEG8000（T4 RNA连接酶1提供）
12. 引物B（5'-GAGAGAGGATCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3'）（5μM）
13. Pfu DNA聚合酶（或同等物）
14. 10x Pfu DNA聚合酶缓冲液（或等同物，提供MgCl 2或MgSO 4）
15. dNTPs（5μM）
16. 2％琼脂糖凝胶
17. Generator低范围DNA梯形图（Thermo Fisher Scientific）
18. GeneJET凝胶提取试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Fermentas，目录号：K0691）
  注意：只有ssDNA不需要时，才需要其他材料和试剂 5'-末端磷酸化：T4多核苷酸激酶（PNK，New England Biolabs，目录号：M0201）和T4多核苷酸激酶反应缓冲液（New England Biolabs，目录号：M0201）

设备

从蛋白质纯化核酸
1. 热块
2. PCR机
3. 冷却台面Eppendorf离心机
4. 冷冻（-20°C）
富集和准备ssDNA分子进行测序
1. 热块
2. PCR机
3. 台式离心机
4. 琼脂糖凝胶电泳设备

程序

从蛋白质纯化核酸
1. 取纯化的蛋白质样品（例如50-500μl，蛋白质浓度高达10μM）。
2. 加入CaCl 2至终浓度为5μM。
3. 加入1/10体积的蛋白酶K溶液（例如至450μl蛋白/CaCl 2溶液，加入50μl蛋白酶K溶液）。
4. 在65℃在加热块中孵育4小时。或者，小体积（高达200μl）可以在65℃下在PCR仪中孵育4小时。
5. 以1:1的比例加入Roti苯酚/氯仿/异戊醇（pH 7.5-8.0）（例如加至500μl，加入500μl苯酚/氯仿/异戊醇）。
6. 以最大速度涡旋5秒。
7. 在台式离心机中以最大速度离心样品15分钟
8. 小心吸取上部分（含水相的水相）核酸）至干净的离心管。小于实际（例如来自500μl样品的部分，仅需450μl）。这个避免与低级部分（含有机相的混合物）混合蛋白质），其含有可能干扰的酚下游步骤。舍弃较低分数。
9. 如果上部分的总体积大于500μl，则将样品平均分布在多个管上。
10. 以2:1的比例（乙醇：样品）加入99％乙醇。
11. 加入10微升线性聚丙烯酰胺（5微克/微升）作为载体
12. 将样品在-20°C孵育至少16小时。小核酸需要更长时间才能沉淀
13. 在台式离心机中在4℃以最大速度（13,000rpm）离心30分钟
14. 用移液管除去所有乙醇，应该看到一个小白色/透明的小丸 - 尽量不要打扰小丸
15. 加入500μl预冷-20°C，70％乙醇的沉淀。
16. 在台式离心机中以4℃以最大速度离心15分钟
17. 用移液管除去所有乙醇 - 应看到一个小白色/透明的小丸 - 尽量不要打扰小丸
18. 在50℃下孵育反应管，直到所有乙醇蒸发（5-10分钟）
19. 重悬在50微升无RNA酶MQ水中的核酸。
20. 通过 P标记（参见图1）或使用for分析核酸富集和制备用于测序的ssDNA分子（方法B 下面）。对于³² P标记，使用T4多核苷酸激酶（T4 PNK）根据制造商提供的协议。
富集和准备ssDNA分子进行测序
1. 加入1微升无DNA酶的RNase A到50微升纯化的ssDNA
2. 在RT孵育10分钟。
3. 为了多腺苷酸化ssDNA，使用末端脱氧核苷酸转移酶根据制造商提供的协议 10μl5x TdT反应缓冲液
  36.5μlssDNA（30-100ng，如有必要，加入MQ水）
  1.5μldATP（100mM） 1.5μlTdT
4. 混合并在37℃下孵育60分钟
5. 在70°C孵育10分钟以灭活TdT。
6. 使用QIAquick核苷酸去除试剂盒纯化样品根据制造商提供的手册。在30μlMQ中洗脱水。
  注意：
  1. 其他核酸纯化试剂盒可能也适合于纯化核酸。然而，大多数核酸酸纯化试剂盒不纯化小于100nt的核酸。确保您使用的套件适合您的核酸大小净化。
  2. 下一步取决于a的存在磷酸化的5'末端。如果你不确定是否你的小DNA分子有一个磷酸化的5'端，这是可能的根据手册用T4多核苷酸激酶磷酸化它由制造商提供。 5'末端磷酸化后，纯化样品使用QIAquick核苷酸去除试剂盒手册由制造商提供。在30μlMQ水中洗脱。
7. 将磷酸化的5'-末端引物引物A（参见注释a和e） ssDNA分子与3'端poly A尾通过混合16微升ssDNA，1微升引物A，6μlATP（10mM），6μl10x反应缓冲液，30μl50％PEG8000 （w/v）和1μlT4 RNA连接酶。在25°C孵育16小时。 T4 RNA连接酶因为其可以将ssDNA链（引物）的3'-末端连接到a 5'-末端磷酸化的ssDNA链（ssDNA分子具有3'-末端聚 A tails）。
8. 使用QIAquick核苷酸纯化样品拆卸套件根据制造商提供的手册。洗脱在30μlMQ水中
9. 为了富集ssDNA分子，使用引物A和B扩增ssDNA分子 2μl10x Pfu聚合酶缓冲液（含有MgCl 2或MgSO 4）
  14μl具有5'寡核苷酸和3'多聚A尾的ssDNA
  1μl引物A（5μM）
  1μl引物B（5μM）
  1μldNTPs（5μM）
  1μlPfu聚合酶
10. 运行PCR
  95℃1分钟
  ----------
  20个周期：
  95℃1分钟（变性）
  40℃下30秒（退火）
  72℃1分钟（伸长）
  ----------
  72℃1分钟
  注意：
  1. 退火温度取决于你的引物。的延伸时间取决于你想扩增的DNA。的所需的循环量取决于模板的量和所需产品数量。通常，较少的循环对于dsDNA是更好的质量，而更多的循环产生更多的dsDNA片段。
  2. 在2％琼脂糖凝胶上运行PCR产物。
  3. 有时在PCR之后出现两个（或更多）条带。最低的（最小）带通常对应于仅含有的PCR产物但不含目标DNA。基于您的共纯化的大小 ssDNA，你应该能够预测成功的预期大小产生和扩增的dsDNA产物（参见图2）。切出乐队并从该条带中纯化dsDNA片段 GeneJET凝胶提取试剂盒按照提供的方案制造商。
  4. 如果dsDNA分子的产量太低，克隆/测序，可以对从纯化的dsDNA重复PCR 凝胶。确保重复凝胶纯化，也作为产品其他长度可能会放大。
  5. 纯化的dsDNA PCR产物可以通过修改的Illumina测序方案直接测序。为此，确保引物A含有合适的序列对于所使用的测序平台（与您的测序讨论这一点公司）。或者，可以克隆纯化的dsDNA PCR产物在使用在任一端引入的KpnI限制性位点的载体中 PCR产物（或其他限制性位点，如果您设计了自己的引物）。或者，可以通过TOPO克隆来克隆产物（Life Technologies）在用Taq加入3'-末端腺嘌呤基团后聚合酶（参见制造商提供的方案）。后转化这些载体，可以纯化质粒并测序使用标准协议。测序后，来自的链单链分子可以通过其存在来鉴定 5'-末端引物A序列和3'-末端聚腺苷酸序列。

代表数据

图1.具有 Tt Ago或共同纯化的解析的核酸的20％变性聚丙烯酰胺凝胶> Tt ，2014a）。核酸是通过用³²取代5'-磷酸（左凝胶）或5'-OH基团（右凝胶）标记的< P使用T4多核苷酸激酶。标记的核酸用核糖核酸酶A，DNA酶I或核酸酶P1切割（切割ssRNA和ssDNA）。左凝胶显示用小的ssDNA分子与5'-末端磷酸共纯化的Tt Ago。正确的凝胶显示，Tt Ago和 AgoDM与未定义长度的长ssRNA分子共同纯化。图改编自Swarts等人。（2014a）。

图2.具有溶解的富集dsDNA分子的2％琼脂糖凝胶。 M：Generator低范围DNA梯。对应于标记物泳道中的DNA的大小以bp表示。泳道1和2含有产生的dsDNA样品，在该方案的步骤B1中向其中加入21nt ssDNA。泳道3和4包含具有仅由寡核苷酸组成的生成的dsDNA分子和没有ssDNA插入片段的3'-端聚腺苷酸尾的阴性对照。注意，有时，表示具有和不具有插入物的分子的条带将出现在感兴趣的样品中。在这种情况下，请确保选择正确的谱带（通常是上谱带，因为它包含插入片段，因此较大），以进一步处理和测序。

致谢

这项工作得到了荷兰科学研究组织（NWO）给J.O.的资助。（NWO-TOP，854.10.003）。

参考文献

Swarts，DC，Jore，MM，Westra，ER，Zhu，Y.，Janssen，JH，Snijders，AP，Wang，Y.，Patel，DJ，Berenguer，J.，Brouns，SJand van der Oost， 2014a）。由原核生物Argonaute进行的DNA引导的DNA干扰。自然 507（7491）：258-261。
Swarts，D.C.，Jore，M.M.and van der Oost，J.（2014b）。嗜热栖热菌（Thermus thermophilus）的表达和纯化 argonaute蛋白。生物协议 4（19）：e1253。