材料和试剂

标准细胞系[例如 MeWo（ATCC HTB-65 ^TM）; ARPE19（ATCC CRL-2302 ^TM）; Vero（ATCC CCL-81 ^TM）]
荧光标记的病毒原种（遗传工程改造的VZV-66GFP，HSV1-gC-GFP和PRV-IE180-GFP由Paul R.Kinchington教授，匹兹堡大学匹兹堡大学赠送）
上述细胞的生长培养基（例如项目＃6，成纤维细胞培养基）
注意：但是，它可以是其他任何病毒和细胞对的媒介。
4％多聚甲醛（EMS 15710）在具有二价阳离子的磷酸盐缓冲盐水（例如Biological Industries，目录号：020201A）中。
高葡萄糖DMEM（Biological Industries，目录号：010551A）
胎牛血清（Biological Industries，目录号：041271A）
谷氨酰胺（Biological Industries，目录号：030201）
青霉素 - 链霉素（Biological Industries，目录号：030311）
琼脂糖低EEO（Hispanagar，目录号：D1500）
成纤维细胞培养基（参见配方）
覆盖媒体免费病毒（见配方）
结晶紫（Sigma-Aldrich，目录号：C0775）（参见Recipes）

设备

24孔组织培养板
培养箱37℃，5％CO 2
表光荧光倒置显微镜

程序

细胞相关水痘带状疱疹病毒（VZV）
1. 在24孔板中生长MeWo或ARPE19细胞，直到它们达到90％融合（约300,000或200,000个细胞/孔，接种前〜24小时感染）。使用500微升/孔体积生长和感染细胞。在Heineman和Cohen中记载了MeWo细胞用于VZV的用途（1994），Eisfeld等人（2007）和Markus等人（2011）。
2. 准备 10倍系列稀释的VZV感染的MeWo细胞。通常，稀释度范围为初始原料的10 -1 -10至10 -6 -6 。音量接种到每个孔可以高达500微升。
3. 添加感染细胞至含有90％汇合的初始细胞的24孔板培养物一式三份，并在37℃孵育至少2小时。在添加后没有特殊的需要更换介质接种物，因此感染的细胞也可以留在过夜。不需要琼脂覆盖，因为没有由VZV形成二次噬菌斑，其不会将病毒体释放到覆盖介质中
4. 使用a 10x物镜用荧光显微镜，计数所有荧光焦点（荧光细胞组）在2-5天后。采取注意不要计数相同的荧光对焦两次，并且屏幕全部井顺序相同。这个过程可以用显微镜自动化配备了计算机化的舞台和图像分析软件。我摔倒荧光焦点已经发展成斑块，然后用于的单位最终病毒浓度是噬菌斑形成单位（PFU）
5. 至计算PFU/ml，使用孔中的平均焦点数输入病毒稀释导致10-100个灶。例如，如果 10 稀释导致每孔24,26和30个荧光病灶接种量为100μl，则库存浓度为
无细胞VZV
1. 在24孔板中生长ARPE19细胞，直到它们达到90％汇合（在接种前约〜200,000个细胞/孔〜感染前〜24小时）。这些细胞在较低VZV浓度下更容易感染 MeWo或MRC5细胞（Schmidt-Chanasit等人，2008; Pasdeloup等人， 2013）。使用500μl/孔生长和感染细胞
2. 准备5倍系列稀释的无细胞VZV在高葡萄糖DMEM。在我们的经验中，稀释病毒在生长培养基中的细胞对血清的存在不敏感似乎不影响病毒感染性。通常，稀释度的范围为1:5至1:625 初始库存。
3. 用100-150μl/孔的病毒稀释液接种ARPE19细胞一式三份。
4. 在CO 2培养箱中，让病毒吸附到细胞单层2小时，偶尔搅动。
5. 取出接种物，每孔加入0.5ml预热的生长培养基。不需要琼脂覆盖层，因为没有形成二次噬菌斑 VZV，其不会将病毒体释放到覆盖培养基中
6. 监测细胞的荧光灶形成。通常，5天是足以使焦点容易计数，但这可以变化病毒和实验之间
7. 使用10x物镜荧光显微镜，计数所有荧光灶（组荧光细胞）3-5天后。小心不要计数相同的荧光焦点两次，并筛选所有的孔在相同订购。这个过程可以用配备有a的显微镜自动化计算机化阶段和图像分析软件。如果所有荧光焦点已经发展成为用于最终病毒的单位然后单位浓度为PFU
8. 要计算PFU/ml，请使用平均值在输入病毒稀释导致的孔中的病灶数目 10-100灶。例如，如果1:25稀释导致25,26和 30荧光灶，接种量为100μl，然后加入母液浓度为
无细胞PRV和HSV1
1. 在24孔板中生长Vero细胞（绿色非洲猴肾细胞）直到它们达到90％汇合（〜400,000个细胞/孔，接种〜24小时感染前）。 Vero细胞用于HSV1和PRV的用途是记载于Moffat等人（1998），Nicola和Straus（2004）和 Pasdeloup （2013）。
2. 准备10倍连续稀释的病毒在高葡萄糖DMEM。通常，稀释的范围是 10 ^-2至10 ^-7。将稀释液置于冰上。
3. 接种100微升/孔的病毒一式四份的Vero细胞。
4. 让病毒在CO 2培养箱中吸附细胞单层1小时，每15分钟搅动一次。
5. 取出接种物并用1ml覆盖物覆盖细胞每孔含有0.3％琼脂糖的培养基。快速工作，使媒体在加入细胞之前不会开始凝固
6. 监测培养物的荧光灶的形成，通常少于4天。
7. 使用10倍物镜用荧光显微镜，计数所有荧光灶（荧光细胞组）3-5天后每孔天。注意不要计数相同的荧光对焦两次，和以相同的顺序筛选所有孔。这个过程可以自动化用装备有计算机化阶段和图像分析的显微镜软件。如果所有荧光焦点已经发展成斑块然后单位用于最终病毒浓缩的是PFU
8. 计算 PFU/ml，使用输入病毒的孔中的平均焦点数稀释导致10-100个灶。例如，如果10 ^-4稀释导致每孔40,43和45个荧光灶，并接种量为100μl，则库存浓度为
9. 如果病毒没有使用荧光标记，或者期望计数噬菌斑而不是荧光位点，通过染色显示噬斑含有0.1％结晶紫的培养物：小心地提起覆盖的琼脂培养基，使用刮刀，注意不打扰细胞单层。固定细胞与100微升4％PFA的PBS在室温下30分钟。用PBS洗涤两次，并加入0.1％结晶紫溶液10分钟。小心用水洗涤，直到液体不再有蓝色的痕迹（通常约5次冲洗）。
10. 计数噬菌斑并如上计算PFU/ml。
感染复数（MOI）计算
1. 一般来说，感染复数的公式如下：
2. 为了计算MOI，你应该首先确定数字的感染细胞和接种病毒的滴度他们
3. 例如，如果2.5×10 4个人包皮成纤维细胞接种在24孔板的每个孔中，加入250μl10 4 PFU/ml VZV 用来感染它，MOI是

代表数据

图1.使用荧光病毒的感染灶的显微外观。用细胞相关的VZV-23GFP感染ARPE19（A，B）或MeWo（C，D）细胞。示出了相同场的荧光（A，C）和相位对比（B，D）图像。比例尺=200μm

图2.使用结晶紫染色的HSV1gCGFP的噬斑测定。感染后4天，如本文所述固定细胞和染色。病毒浓度从左到右降低。结晶紫染色细胞，这允许清楚的斑块的可视化。箭头指向产生可量化噬斑的稀释。对照，未感染的孔不产生任何可检测的斑块（未感染）。

食谱

成纤维细胞培养基
对于500ml，将450ml高葡萄糖DMEM与50ml胎牛血清组合。补充2.5ml谷氨酰胺和5ml青霉素/链霉素
覆盖媒体免费病毒
事先，准备1.2％纯的琼脂糖的储备液，通过高压灭菌法在PBS中电泳。将所需量的培养基预热至37℃。
在使用前，将琼脂在微波炉中再煮沸以液化。用生长培养基以1琼脂体积与3培养基体积的比例稀释琼脂，例如在50ml管中将6ml琼脂加入18ml培养基中。这将导致在培养基中的0.3％琼脂，其足以覆盖一个24孔板。
将覆盖介质管放在约40°C水的烧杯中，以防止凝固
水晶紫
将0.1％结晶紫溶解在10％乙醇（例如，5ml乙醇和45ml H 2 O）中。
首先将粉末加入适量的100％乙醇中使其完全溶解，然后加入所需量的水生成10％乙醇。

致谢

HSV1滴定基于Maya Ilouze博士（Sheba Medical Center，Tel-HaShomer，Israel）的未发表的方案。我们衷心感谢以色列科学基金会238/11的赠款和马克西米利亚古德基金会的捐赠。

参考文献

Eisfeld，A.J.，Yee，M.B.，Erazo，A.，Abendroth，A.and Kinchington，P.R。（2007）。水痘带状疱疹病毒对I类主要组织相容性复合物表面表达的下调涉及开放阅读框架66蛋白激酶 - 依赖和独立的机制。 Virol 81（17）：9034-9049。
Heineman，T.C。和Cohen，J.I。（1994）。核糖核酸还原酶水痘带状疱疹病毒大亚基的缺失会损害病毒在体外的生长。 J Virol 68（5）：3317-3323。
Markus，A.，Grigoryan，S.，Sloutskin，A.，Yee，M.B.，Zhu，H.，Yang，I.H.，Thakor，N.V.，Sarid，R.，Kinchington，P.R.and Goldstein，源自人类胚胎干细胞的神经元的水痘带状疱疹病毒（VZV）感染：轴突的直接证明感染，VZV的转运和生产性神经元感染。 J Virol 85（13）：6220-6233。
Moffat，J.F.，Zerboni，L.，Kinchington，P.R.，Grose，C.，Kaneshima，H。和Arvin，A.M。（1998）。疫苗Oka株的水痘 - 带状疱疹病毒以及在SCID-hu小鼠中表现的糖蛋白C在α疱疹病毒毒力中的作用。病毒学72（2）：965-974。
Nicola，A.V.and Straus，S.E。（2004）。细胞和病毒对快速吞噬单纯疱疹病毒进入的需求。 Virol 78（14）：7508-7517。
Pasdeloup，D.，Labetoulle，M。和Rixon，F.J。（2013）。单纯疱疹病毒1和假狂犬病毒感染对中心体功能的不同影响 J Virol 87（12）：7102-7112。
Schmidt-Chanasit，J.，Bleymehl，K.，Rabenau，HF，Ulrich，RG，Cinatl，J.，Jr.and Doerr，HW（2008）。体外在人视网膜色素上皮细胞中水痘带状疱疹病毒的复制。 J Clin Microbiol 46（6）：2122-2124。
Sloutskin，A.和Goldstein，R.S.（2014）。水痘带状疱疹病毒的实验室制备：含病毒上清液的浓缩，使用碎片级分和用于一致的无细胞VZV感染的磁感染。 J Virol Methods 206：128-132。