材料和试剂

本塞姆氏烟草（ N。benthamiana ）植物
根癌土壤杆菌菌株GV3101（pMP90）
细菌酵母提取物（BD Biosciences，目录号：288620）
Bacto胰蛋白胨（BD Biosciences，目录号：211699）
氯化镁六水合物（EMD Millipore，目录号：442611）
乙酰丁香酮（Sigma-Aldrich，目录号：D134406-5G）
地塞米松（Sigma-Aldrich，D4902-1G）
Trizma Tris碱（Sigma-Aldrich，目录号：93362）
氯化钠（EMD Millipore，目录号：567442）
Nonidet P-40（Sigma-Aldrich，目录号：21-3277）
植物蛋白酶抑制剂混合物（Sigma-Aldrich，目录号：P9599-5M）
SDS（Sigma-Aldrich，目录号：L3771-100G）
甘油（EMD Millipore，目录号：356350）
β-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M3148-25ML）
EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：E6758-100G）
BSA（Sigma-Aldrich，目录号：A4503-100G）
溴酚蓝（EMD Millipore，目录号：BX1410）
抗HA单克隆抗体基质（Roche Diagnostics，目录号：11867423001）
Tris-HEPES-SDS聚丙烯酰胺凝胶（Thermo Fisher Scientific，目录号：25204）
抗HA过氧化物酶（Sigma-Aldrich，目录号：H6533-1VL）
高灵敏度链霉亲和素-HRP偶联物（Thermo Fisher Scientific，目录号：21130）
ImmunoStar HRP底物试剂盒（Bio-Rad Laboratories，目录号：170-5070）
N，N-乙基马来酰亚胺（Sigma-Aldrich，目录号：E3876-5G）
羟胺（Sigma-Aldrich，目录号：467804-10ML）
1 - 生物素酰氨基-4- [4'（马来酰亚胺甲基） - 环己烷 - 甲酰氨基] - 丁烷（EZ-link BMCC-生物素）（Thermo Fisher Scientific，目录号：21900）
硝基纤维素膜（Thermo Fisher Scientific，目录号：WP4HY00010）
Metro-Mix 360（加拿大Sun Gro园艺）
LB液体介质（见配方）
裂解缓冲液（见配方）
4x SDS加样缓冲液（见配方）
5x非还原蛋白样品缓冲液（见配方）

设备

共聚焦显微镜系统（Leica Microsystem，型号：TCS SP5）
微型蛋白质电泳和印迹系统（Bio-Rad Laboratories）
台式离心机5424（Eppendorf）
实验室管旋转器（Thermo Fisher Scientific）
Gene Pulser（Bio-Rad Laboratories，目录号：1652076）
1ml注射器（BD Biosciences，目录号：305945）

程序

本生烟草中的瞬时表达测定
如先前所述进行瞬时表达测定（DeYoung等人，2012）。简要地说：
1. N。本生烟草植物生长在装满的小塑料盆中 Metro-Mix 360在8/16小时光周期下以150μmol/m/s和23℃进行
2. N20sYFP：HA和n20sYFP：HA的地塞米松诱导型构建体动员到根癌土壤杆菌菌株GV3101（pMP90）中电穿孔。
3. 在Luria-Bertani液体中过夜培养培养基，细胞（7ml培养物）沉淀并重悬于10mM MgCl 2溶液和100μm的乙酰丁香酮，并稀释悬浮液到渗透前OD 600 = 0.3。
4. 将细胞孵育在室温下孵育2小时，并用无针1ml注射器浸润到4周龄（用于瞬时表达的最佳年龄）的叶中。本生植物。至少应有六个完全展开的叶渗入一次实验。
5. 通过诱导转基因在接种后40小时用50μM地塞米松喷洒叶子。样品收获地塞米松4至6 h后进行蛋白提取应用。
6. 在进行激光扫描共聚焦显微镜检查施用地塞米松5 h后确认sYFP的表达融合。从浸润的叶面积剪下1cm×1cm的组织并放置在载玻片中心的ddH 2 O 2滴中。封面后放置载玻片，使用Leica SP5系统检查载玻片。
免疫沉淀和免疫印迹
1. 对于总蛋白提取，研磨六个浸润的叶裂解缓冲液。组织可以在液氮中快速冷冻并储存在-80℃直至需要
2. 将匀浆在4℃下以13,000rpm离心两次，每次10分钟，将上清液转移至新管中。
3. 每个中加入100μl抗HA单克隆抗体基质匀浆。然后将混合物在4℃下孵育过夜并旋转端到端。
4. 通过在16,000×g离心10秒钟使树脂沉淀，并用1ml裂解缓冲液洗涤三次。
5. 对于免疫印迹，将免疫沉淀物与4×SDS混合加样缓冲液以3:1的比例混合，煮沸10分钟，然后分离在4％至20％（w/v）梯度Tris-HEPES-SDS PAGE上。
6. 然后将蛋白质样品转移到硝酸纤维素膜上，用抗HA过氧化物酶探测
7. ImmunoStar HRP底物试剂盒用于检测抗体复合物
检测 -Acylation
如Berzat等人（2005）所述进行PBS1 S - 酰化的体外检测。简要地说：
1. 将N20-sYFP：HA或n20-sYFP：HA的免疫沉淀物在1℃下孵育 ml裂解缓冲液与50mM N，N-乙基马来酰亚胺在端对端旋转器上在4℃下封闭48小时以封闭游离的巯基。
2. 的然后洗涤免疫沉淀物，在500μl1M中温育羟胺溶液在端对端旋转器上室温下1小时温度水解Cys-棕榈酸酯硫酯键
3. 的洗涤免疫沉淀物并在500μl50mM Tris（pH 7.4）中孵育 7.0）溶液，其中含有1微米的EZ-Link生物素-MBC，端对端旋转器在室温下标记切割的硫酯键2小时。
4. 洗涤免疫沉淀物，重悬于非还原中蛋白质样品缓冲液，在4％至20％（w/v）梯度上分离 Tris-HEPES-SDS PAGE
5. 将蛋白质样品转移到硝酸纤维素膜上。
6. 将膜在5％无生物素的BSA TBST溶液中封闭1小时然后用链霉亲和素 - 辣根过氧化物酶探测
7. ImmunoStar HRP底物试剂盒用于检测生物素 - 链霉亲和素复合物。

代表数据

代表性数据如图1所示。使用该方案重复该实验三次，得到类似的结果

图1.S-酰化介导PBS1定位到PM。 A。 PBS1中预测的N-末端S-酰化基序是质膜定位所需的。 N20：sYFP表示的前20个氨基酸的融合 PBS1，其包含预测的棕榈酰化基序，到超黄色荧光蛋白。 n20是具有G2A/C3AC/6A三重突变的片段。两种融合蛋白在本塞姆氏烟草中瞬时表达。在地塞米松诱导后5小时进行共聚焦显微镜检查。所有图像是来自Z堆叠的三维投影。观察到N20：sYFP定位于质膜，并且观察到移动的囊泡样结构，当酰化蛋白过表达时，报道了这种结构（2006年; Vilas等人，2006; Joensuu& em]等人，2010）。然而，n20：sYFP融合仅作为胞质链检测。 YFP信号显示为绿色的假色。 B.PBS1是S-酰化的。细胞提取物。本发明的表达N20：sYFP-HA或n20：sYFP-HA的组织使用抗HA基质（IP）进行免疫沉淀。将免疫沉淀物用抗HA抗体（IB）作为上样对照进行免疫印迹。同时，用50mM N-乙基马来酰亚胺处理免疫沉淀物以封闭游离巯基，与1M羟胺孵育以水解任何Cys-棕榈酸酯硫酯键，然后用在50mM中的1μmEZ-Link生物素-BMCC处理Tris（pH 7.0）以标记由裂解的硫酯键产生的新暴露的游离巯基。通过SDS-PAGE分辨修饰的免疫沉淀，并通过蛋白质印迹（WB）用链霉亲和素辣根过氧化物酶进行分析。摘自Qi等人（2014）（版权美国植物生物学家协会）。

笔记

在样品制备的任何步骤中都不能使用强还原剂，例如DTT或β-巯基乙醇。
共聚焦显微镜仅用于快速确认蛋白质表达。以下免疫沉淀和体外标记不是必需的。
这种技术可以扩展到在其他真核异源表达系统如毕赤酵母（Pichia pastoris），草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）和成纤维细胞等表达的重组蛋白质。 br />

食谱

LB液体培养基（每升）
10g胰蛋白胨
5g酵母提取物
10克NaCl
裂解缓冲液
50mM Tris（pH7.5） 150mM NaCl 0.1％（v/v）Nonidet P-40
1％（v/v）植物蛋白酶抑制剂混合物
4x SDS上样缓冲液
50mM Tris-HCl（pH6.8）
2％（w/v）SDS
10％（v/v）甘油 1％（v/v）β-巯基乙醇 12.5mM EDTA
0.02％（w/v）溴酚蓝
5x非还原性蛋白质样品缓冲液
10％（w/v）SDS
1 M Tris-HCl（pH 6.8）
25％（w/v）蔗糖 0.01％（w/v）溴酚蓝

致谢

这项工作得到国立卫生研究院国家综合医学科学研究所（授予号R01 GM046451至R.W.I）的支持。该协议改编自Qi等人之前的工作。（2014）。

参考文献

Ade，J.，DeYoung，B.J.，Golstein，C.and Innes，R.W。（2007）。由细菌蛋白酶间接激活植物核苷酸结合位点 - 富含亮氨酸的重复蛋白。 Proc Natl Acad Sci USA 104（7）：2531-2536。
Berzat，A.C.，Buss，J.E.，Chenette，E.J.，Weinbaum，C.A.，Shutes，A.，Der，C.J.，Minden，A.and Cox，A.D。（2005）。 Rho家族GTPase，Wrch-1（Wnt调节的Cdc42同源物）的转化活性，依赖于新的羧基末端棕榈酰化基序。 J Biol Chem 280（38）：33055-33065。
DeYoung，B.J.，Qi，D.，Kim，S.H.，Burke，T.P.and Innes，R.W。（2012）。激活植物核苷酸结合富亮氨酸重复疾病抗性蛋白通过修饰的自身蛋白。细胞微生物 14（7）：1071-1084。
Hemsley，P.A.，Taylor，L.and Grierson，C.S。（2008）。在植物中测定蛋白质棕榈酰化。植物方法 4： 2.
Joensuu，J.J.，Conley，A.J.，Lienemann，M.，Brandle，J.E.，Linder，M.B.and Menassa，R。（2010）。疏水蛋白融合蛋白，用于本氏烟草中的高水平瞬时蛋白表达和纯化。。 Plant Physiol 152（2）：622-633。
Qi，D.，Dubiella，U.，Kim，S.H.，Sloss，D.I.，Dowen，R.H.，Dixon，J.E。和Innes，R.W。（2014）。抗病蛋白抗体对蛋白激酶AVRPPHB SUSCEPTIBLE1的识别抗性对SYRINGAE5的依赖取决于S-酰化和在AVRPPHB SUSCEPTIBLE1中暴露的环。植物生理学 164（1）：340-351。
Ren，J.，Wen，L.，Gao，X.，Jin，C.，Xue，Y。和Yao， CSS-Palm 2.0：更新的棕榈酰化位点预测软件蛋白Eng Des Sel 21（11）：639-644。
Shao，F.，Merritt，P.M.，Bao，Z.，Innes，R.W.and Dixon，J.E。（2002）。 Yersinia效应物和假单胞菌无毒蛋白定义了一个家族半胱氨酸蛋白酶在细菌发病机理中起作用。 Cell 109（5）：575-588。
Vilas，G.L.，Corvi，M.M.，Plummer，G.J.，Seime，A.M.，Lambkin，G.R。和Berthiaume，L.G。（2006）。胱天蛋白酶活化的p21活化蛋白激酶2（PAK2）的翻译后豆蔻酰化增强晚期凋亡事件。/a> Proc Natl Acad Sci USA 103（17）：6542-6547。
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