材料和试剂

细菌：革兰氏阴性大肠杆菌（大肠杆菌）或酵母酿酒酵母（酿酒酵母 /> 注意：
淀粉样蛋白存在于大肠杆菌和酿酒酵母中。在两种生物体中，淀粉样蛋白可以是功能性的。在大肠杆菌中，最知名的实例是卷曲蛋白，其在胞外培养基中组装并允许细菌的表面细胞到表面并维持生物膜的形成（Chiti和Dobson，2006; Chapman等人，2002）。
在酿酒酵母中，淀粉样蛋白在某些生理条件下赋予细胞选择优势并且它们不是有害的（Chien等人，2004; Shorter和Lindquist，2005; Wickner等人，2007），一些实例是Sup35p y Ure2p，Rnq1p。 Sup35从可溶性转变为淀粉样蛋白状态推动了翻译终止活性的降低（Wickner等，1995）。
蛋白酶抑制剂混合物（Roche Diagnostics，目录号：04 693 159 001）
硅胶珠（1mm裂解基质C）（MP Biomedicals，目录号：6912-050）
纯琼脂糖D2（Pronadisa，目录号：8034）
洗涤剂：SDS（Bio-Rad Laboratories，目录号：161-0301）和Sarkosyl 97％N-月桂酰肌氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：L-9150）
PVDF膜（Bio-Rad Laboratories）
抗体
注意：
取决于您工作的蛋白质，抗体可能针对您正在研究聚集的蛋白质。如果使用者要产生重组蛋白，推荐的策略是在蛋白的氨基或羧基末端包括标签，并使用针对标签的特异性抗体。一个实例是组氨酸标签，相应的抗体是单克隆抗多组氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：H1029）。
识别单体状态的抗体仍然能够鉴定聚合物中的蛋白质，即使蛋白质构象已经改变。通常单体抗体具有广泛的识别表位。在我们手中，使用的抗体是：
对于大肠杆菌，制备了针对RepA（在用可溶性RepA免疫的兔中产生的）的自制多克隆抗体，（Gasset-Rosa等人，2014）;和抗His-RepA（WH1）（Sigma-Aldrich，目录号：H1029）的单克隆抗多组氨酸（Molina-García和Giraldo，2014）。两者都有效。
对于酿酒酵母，针对Sup35蛋白（未公开）的HA（人流感血凝素）标记的抗HA抗体（Roche Diagnostics，目录号：12CA5）。
细胞培养基
1. Luria Bertani（LB）培养基（见配方）
2. 酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YPD）（见Recipes）
裂解缓冲液（见配方）
运行缓冲区（参见配方）
加载缓冲区（参见配方）
传输缓冲区（请参阅配方）

设备

Fast Prep-MilliPore/MP FastPrep-24匀浆器（目录号：6004-500）
水平琼脂糖电泳系统（电泳电源EPS601通用电气公司）
湿/罐转移印迹系统（Bio-Rad Laboratories）

程序

在调整条件下的生长细胞
收获细胞。
1. 细菌：通过离心收获细胞（25ml O.D. = 2）（10分钟， 3500rpm，4℃）。然后，将细胞重悬在400μl裂解缓冲液中
2. 酵母：通过离心（5分钟，10分钟）收获细胞（200ml O.D. = 0.8） 3500rpm，4℃）。并且，将细胞重悬在500μl裂解缓冲液中。
将悬浮液转移到含有二氧化硅珠的管中（通常1/3体积就足够了）。
裂解细胞。
1. 细菌：使用Fast-Prep 24匀浆器裂解细胞（4个循环在4℃下，每次30秒）。并且，用3μl的细胞裂解物稀释 30μl用裂解缓冲液，然后加入10μl4x上样缓冲液样品
2. 酵母：使用Fast-Prep 24匀浆器裂解细胞（在速度V下5个循环，每个在4℃下30秒）。并且，向30μl裂解物中加入10μl的4x上样缓冲液。
在室温下孵育样品10分钟。
将它们装入琼脂糖凝胶中
1. 在1x TAE中制备1.5％的200ml琼脂糖注意：将琼脂糖悬浮液加热至融化，然后将SDS加至0.1％。
2. 倒入20厘米×24厘米水平板模具。确保浇铸托盘位于平坦表面上。
  注意：
  1. 消除所有可能的气泡。
  2. 使用水平琼脂糖进行琼脂糖电泳电泳系统，样品需要长距离运行以解决高分子量的聚合物。
3. 安装一个厚梳子（例如，> 2 mm，20-well），每个样品可装入40μl。
4. 将凝胶浸没在1×TAE-0.1％SDS的水平电泳容器中10℃。
在10℃下以100V进行电泳7.5小时注意：为了检测具有高疏水性特征的低聚物，在较低电压50V和室温下，用样品中的1％（终浓度）的Sarkosyl（加样缓冲液中的4％Sarkosyl），在室温下12小时。运行缓冲液的浓度如前所述是TAE 1x和0.1％SDS。
注意：电泳时要格外小心，避免电击危险。
切割调整为琼脂糖凝胶尺寸的PVDF膜，并且将2片与Whatman纸相同尺寸切割。
将凝胶紧紧地连接到PDVF膜上，并在每一侧添加一块Whatman纸。
注意：一切都应该用转移缓冲液预湿。请确保两者之间没有气泡。
将铸件放入湿转移印迹中，并用缓冲液1x TAE-0.1％SDS覆盖注意：电泳时要格外小心，避免电击危险。
在16 V/400 mA和10°C下运行传输15 h
用适当的抗体进行Western印迹以检测聚合物

食谱

Luria Bertani（LB）培养基
细菌胰蛋白胨10g/L
酵母提取物5 g/L
NaCl 5g/L
酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YPD）
2％细菌蛋白胨 2％葡萄糖 1％酵母提取物
裂解缓冲液
25mM Tris-HCl（pH 6.8）
250mM NaCl 5 mM EDTA
10％甘油，补充蛋白酶抑制剂（每10ml一片，每片10ml）
运行缓冲
1x TAE（Tris乙酸酯EDTA）
0.1％SDS
加载缓冲区（4x）
0.5％TAE
5％甘油 2％的sarkosyl
0.1mg/ml溴酚蓝加蛋白酶抑制剂（每10ml一片，每片1ml）
传输缓冲区
1x TAE（Tris Acetate EDTA）
0.1％SDS

致谢

我们感谢Rafael Giraldo教授的鼓励和持续的支持，以及西班牙MINECO资助（BIO2012-30852和CSD2009-00088）。

参考文献

Coustou，V.，Deleu，C.，Saupe，S.J.and Begueret，J。（1999）。突变孢子虫的[Het-s]朊病毒类似物的突变分析。短的N-末端肽允许朊病毒繁殖。 153（4）：1629-1640。
Eaglestone，S.S.，Cox，B.S。和Tuite，M.F。（1999）。翻译终止效率可通过酿酒酵母进行调节通过朊病毒介导的机制引起的环境应激。 EMBO J 18（7）：1974-1981。
Gasset-Rosa，F.，Coquel，AS，Moreno-Del Alamo，M.，Chen，P.，Song，X.，Serrano，AM，Fernandez-Tresguerres，ME，Moreno-Diaz de la Espina，，AB和Giraldo，R。（2014）。在细菌中直接评估朊病毒的繁殖和Hsp70伴侣的表型选择。 Mol Microbiol 91（6）：1070-1087
Molina-García，L.和Giraldo，R。（2014）。 RepA-WH1朊病毒变异体之间的聚集相互作用大肠杆菌 l 01527-01514。
Prusiner，S.B。（2012）。细胞生物学。在神经变性疾病中朊病毒的统一作用。 336（6088）：1511-1513。
True，H.L.，Berlin，I.and Lindquist，S.L。（2004）。翻译的表观遗传调控揭示隐藏的遗传变异以产生复杂的性状。自然 431（7005）：184-187。
Wickner，R.B。（1994）。作为改变的URE2蛋白的 [URE3]：酵母菌中朊病毒类似物的证据 264（5158）：566-569。