材料和试剂

酪蛋白（Hammarsten等级）（BDH Prolabo，VWR International，目录号：440203H）
来自大肠杆菌O111：B4-FITC缀合物（Sigma-Aldrich，目录号：F3665）的脂多糖
多粘菌素B硫酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：P4119）
用于以下实施例（见代表性数据）但对于测定不是必需的蛋白质：
1. LBP人重组体（Sigma-Aldrich，目录号：SRP6033）
2. 牛血清白蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：A7906）
3. 来自马骨骼肌的肌红蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：M0630）
盐
1. Na 2 HPO 4无水物（Merck KGaA，Merck Millipore，目录号：106586）
2. （Merck KGaA，Merck Millipore，目录号：106346）
  />
3. NaCl（Merck KGaA，Merck Millipore，目录号：106404）
4. EDTA二钠盐2-水合物（AppliChem GmbH，PanReac AppliChem，目录号：131669）
羊抗FITC：HRP（Bio-Rad Laboratories，AbD Serotec，目录号：640005）
SIGMAFAST TM opD（Sigma-Aldrich，目录号：P9187）
Tween 20（Merck KGaA，Merck Millipore，目录号：822184）
0.3M NaOH（由50％w/w NaOH溶液制备）（18.94M）（Sigma-Aldrich，目录号：415413）
7.4％HCl（37％市售溶液，用蒸馏水稀释1/5）（Merck KGaA，Merck Millipore，目录号：100317）
含有0.05％Tween 20（PBS-T）的磷酸盐缓冲盐水（PBS）
3 H H 2 SO 4（1.5M）
酪蛋白水解产物溶液（参见配方）
浓缩PB（参见配方）
PBS（请参阅配方）
PBS-EDTA（参见配方）

设备

96孔微板（具有透明平底孔的聚苯乙烯）（Greiner Bio-One GmbH，目录号：762071）
自动（单通道和多通道）移液器和移液器吸头
校准烧杯，量筒和锥形瓶
磁力搅拌棒和磁力搅拌器
手动或自动微孔板清洗机（如，DAS板清洗机）
微离心管（例如，Eppendorf; Kartell，目录号：297，对于1.5ml，和1298，对于0.5ml管）
微板粘合剂密封膜（例如，AlumaSeal II膜; Sigma-Aldrich，目录号：A2350）
微板读数器（装备用于测量492nm处的吸光度）（例如，Beckman Coulter，型号：Biomek 读板器）
具有设定为750rpm（例如，Stuart，型号：SSM5）的小轨道直径（优选1.5mm）的微量滴定板振荡器
pH计
多通道移液器的试剂储液器
刻度
将设定为37℃和150rpm（例如，Panasonic Corporation，SANYO Electric，型号：Orbi-Safe ^TM）的培养箱摇动

程序

确定测定所需的孔数。测试应至少进行一式两份。在下面的ELISA工作表实施例中，如果您在未知蛋白质/肽加上相同稀释度的多粘菌素B（阳性抑制对照）和已知不具有LPS结合能力的蛋白质/肽（阴性抑制对照）的8个系列稀释液中进行测试，您需要52个孔：3×8×2 = 48个用于蛋白质/肽稀释的孔，具有LPS-FITC（参考对照）的两个孔和不具有LPS-FITC（阴性对照）的两个孔。
加入200微升酪蛋白水解产物溶液到96孔微孔板的孔中。用粘合剂膜密封微板，并在4℃下振荡孵育过夜。

单独地，制备LPS O111：B4-FITC缀合物（5μg/ml）的2x溶液和在PBS-EDTA中的待测试的蛋白质/肽（起始稀释度80μg/ml）的2x系列稀释液。制备相同稀释度的多粘菌素B（阳性抑制对照）和阴性抑制对照（例如卵白蛋白）。八个系列¼稀释是大多数蛋白质的最佳选择。对于ELISA工作表示例准备：

2x LPS-FITC的溶液：在PBS-EDTA中的5μg/ml的3.5ml LPS-FITC

在PBS-EDTA中的蛋白质/肽的2x系列稀释液：

表1.制备连续稀释

稀释（稀释）编号	蛋白质/肽的量和来源	PBS-EDTA的体积	蛋白质浓度
1	从5mg/ml储液中取出3.2μl	196.8微升	80μg/ml
2	50微升稀1	150μl	20μg/ml
3	50μldil 2	150μl	5μg/ml
4	50μldil 3	150μl	1.25μg/ml
5	50μl稀释液4	150μl	0.312μg/ml
6	50μldil 5	150μl	0.078μg/ml
7	50μldil 6	150μl	0.020μg/ml
8	50μl的稀释液7	150μl	0.005μg/ml

在各个微量离心管中混合120μlLPS-FITC溶液（2x）与120μl每种稀释液（2x）或PBS-EDTA（参考对照），混匀，并在室温下孵育样品1小时。
吸出涂覆有酪蛋白水解产物的孔的内容物，并在室温下用200μlPBS（无浸泡）洗涤3次，无振荡。
立即，每孔加入100μl预孵育的溶液或PBS-EDTA（阴性对照）一式两份。密封微量培养板，并在室温下以750rpm振荡孵育30分钟
在室温下用200μlPBS-T（无浸泡）洗涤板5次，无振荡。
加入100μl在PBS-T中稀释1/4,000的绵羊抗-FITC：HRP。密封微量培养板，并在室温下以750rpm振荡孵育30分钟
按照步骤7所述清洗平板。
按照制造商的说明准备色原体[邻苯二胺二盐酸盐（OPD）]溶液。
加入100微升OPD溶液到每个孔，孵育20分钟，在室温，不摇动和在黑暗中。
向每个孔中加入25μl3N H 2 SO 4以终止反应。
在30分钟内读取492nm处的孔的吸光度。

根据下式计算每种蛋白质稀释的抑制百分比：[（平均OD参考对照） - （平均OD蛋白稀释+ LPS-FITC）] /（平均OD参考对照）×100。
*或者，在用粘合剂膜密封板之后，可以在37℃下在振荡器中在不摇动的情况下在孵育器中进行步骤6和8中的孵育。

表2. ELISA工作表示例

	1	2	3	4	5	6	7
A	100μlLPS-FITC（参考对照）	100μl 蛋白 dil 1 + LPS-FITC		100μl 多粘菌素 B dil 1 + LPS-FITC		100μl 卵白蛋白 dil 1 + LPS-FITC
B		100μl 蛋白 dil 2 + LPS-FITC		100μl 多粘菌素B dil 2 + LPS-FITC		100μl 卵白蛋白 dil 2 + LPS-FITC
C	100μl PBS-EDTA （阴性对照）	100μl 蛋白 dil 3 + LPS-FITC		100μl 多粘菌素B dil 3 + LPS-FITC		100μl 卵白蛋白 dil 3 + LPS-FITC
D		100μl 蛋白 dil 4 + LPS-FITC		100μl Pol ymyxin B dil 4 + LPS-FITC		100μl 卵白蛋白 dil 4 + LPS-FITC
E		100μl 蛋白 dil 5 + LPS-FITC		100μl Polymyx in B dil 5 + LPS-FITC		100μl 卵白蛋白 dil 5 + LPS-FITC
F		100μl 蛋白 dil 6 + LPS-FITC		100μl 多粘菌素B dil 6 + LPS-FITC		100μl 卵白蛋白 dil 6 + LPS-FITC
G		100μl 蛋白 dil 7 + LPS-FITC		100μl 多粘菌素B dil 7 + LPS-FITC		100μl 卵白蛋白 dil 7 + LPS-FITC
H		100μl 蛋白 dil 8 + LPS-FITC		100μl 多粘菌素B dil 8 + LPS-FITC		100μl 卵白蛋白 dil 8 + LPS-FITC

代表数据

图1.使用报道的方法分析LPS结合用几个分子获得的抑制曲线的实施例。将LPS-FITC（0.25μg/孔）与多粘菌素B（圆圈）的四倍稀释液一起温育， LBP人重组（正方形），牛血清白蛋白（BSA）（倒三角形）和来自马骨骼肌的肌红蛋白（三角形）。值得注意的是，过量的蛋白质/肽在测定中可能具有"区域效应"，如发生的那样多粘菌素B.

笔记

参考对照的理想OD范围为0.6-1.2，其使用0.25μg/孔的LPS-FITC获得。由于FITC含量可能在批次之间变化，在进行抑制测定之前可能需要调整该浓度。用于开发该方法的LPS-FITC的标记程度为7.20μgFITC/mg LPS
蛋白质与LPS的结合不意味着其与生物效应相关。应进行进一步的实验以体外测试活性和在体内。
根据几个因素（氨基酸组成，与LPS相互作用的类型，结合位点数目等），每种蛋白质或肽需要不同的最佳浓度以获得最大抑制。因此，需要测定蛋白质或肽的几种稀释液。
使用竞争性ELISA代替间接ELISA的主要优点是在后者中，待测试的蛋白质/肽被包被到孔中，并且封闭剂可能干扰LPS结合（例如，结合LPS 本身，造成位阻）。酪蛋白水解产物通常在ELISA中用作封闭剂，也用作LPS结合剂，使其可用于所报道的竞争性系统中。
如果待测试的蛋白质或肽结合与酪蛋白水解产物相同或接近的LPS区域，则会发生抑制。虽然酪蛋白水解物由几种衍生肽组成，因此很少了解与LPS结合的机制，因为多粘菌素B抑制LPS与酪蛋白的结合，这表明酪蛋白水解物至少结合LPS的脂质A区。
LPS在不存在去污剂的情况下在PBS-EDTA中孵育，因为LPS和去污剂都具有两亲性质，并且可能给出当一起温育时难以解释的意想不到的结果。

食谱

酪蛋白水解产物
注意：准备基于由Pearce-Pratt和Roser（2010）描述的方法，并进行一些修改。
1. 将2.5g酪蛋白溶解在80ml的0.3M NaOH中并在37℃下以150rpm振荡孵育过夜。
2. 用7.4％HCl缓慢调节pH至8 注意：酪蛋白片段的聚集在pH值瞬时发生被调整。当你保持pH计电极在解决方案之外加入HCl。读取pH或添加更多HCl滴后总是聚集体溶解。
3. 加入2ml浓缩的PB（pH降低至约7.5）
4. 用7.4％HCl调节pH至7.2
5. 用蒸馏水补足至200毫升，必要时重新调整pH值
浓缩的PB（0.75M，pH7.2）
对于50ml溶液：
将4.08g的无水Na 2 HPO 4（Mw：141.96）和1.22g的NaH 2 PO 4水溶液溶解， H 2 O（Mw：137.99）直至50ml，用蒸馏水洗涤。
PBS（150mM，pH7.2）对于1 L溶液：
将1.63g无水的Na 2 HPO 4（Mw：141.96），0.49g的NaH 2 PO 4水溶液，用蒸馏水将H 2 O（Mw：137.99）和7.89g NaCl（Mw：58.44）升至1L。
PBS（150mM，pH7.2）-EDTA（1mM）在PBS中加入浓度为1mM的EDTA二钠盐2-水合物
当EDTA降低pH时，用NaOH
重新调节pH至7.2

致谢

这项工作得到了赠款AGL2011-30563-C03（西班牙部长会议）和CN 2012/155（西班牙Xunta de Galicia）的支持。维多利亚Martínez-Sernández从西班牙文化部长教育部获得了一个前教授奖学金（大学教授项目）。该协议修改自Martínez-Sernández等人。（2014年）。

参考文献

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