材料和试剂

在8至12个培养皿（直径10-cm）中预培养的HeLa细胞（80-100％汇合）
PBS（ - ）（不含Ca 2+ 2+和Mg 2+ 2 + ）
EDTA
甘露醇
蔗糖
HEPES
EGTA
Complete Complete无EDTA（Roche Diagnostics，目录号：11 836 170 001）
digitonin（Wako Pure Chemical Industries，目录号：040-02123）
三氯乙酸（可选）
线粒体分离缓冲液（MTiso缓冲液）（参见配方）
去甲肾上腺素储备溶液（见配方）
digitonin缓冲液（见配方）

设备

文化菜肴
吸气器
细胞刮刀（如橡胶警察）
Dounce匀浆器（玻璃7ml Dounce Tissue Grinder）（WHEATON，目录号：357542）
50 ml管
相差显微镜（直立型，x100〜x400）（用于确认细胞的破坏效率）
离心机[用于在500×g（摇摆转子）和10,000×g（转子转子）上离心]
微管混合器（例如TOMY MT-400，Digital Biology，目录号：MT-400）或涡流混合器
超速离心机（例如，Hitachi，目录号：CS100）（用于在100,000×g （角转子）离心）

程序

通过抽吸从培养皿（包含80-100％融合细胞）中除去培养基，然后向每个培养皿中加入3-4ml含有1mM EDTA的PBS（ - ）。
5分钟后，通过使用细胞刮擦器（或通过温和移液）刮擦细胞，将细胞收集到50ml管中，并以500×g离心（5分钟，4℃）。然后，通过抽吸除去上清液。
通过翻转管，用50ml PBS（ - ）重悬浮沉淀的细胞，然后以500×g离心（5分钟，4℃），随后通过抽吸除去上清液。
通过翻转管将沉淀的细胞用5ml MTiso缓冲液悬浮，然后将悬浮液转移到在冰上预冷却的Dounce匀浆器中。
通过dounce匀浆[约50次（上下）]均质化细胞悬浮液。如果需要，验证细胞在显微镜下的破坏效率。
将匀浆在等体积的340mM蔗糖中在50ml管中堆积，并以500×g（10分钟，4℃）离心以除去作为沉淀的核和未破碎的细胞。
在另一个管（例如5ml管或一些1.5ml管）中收集上清液，然后以10,000×g离心（10分钟，4℃））分离线粒体作为沉淀。
用1ml含适当浓度的毛地黄皂苷（通常为0.15-5mg/ml，参见Recipes）（毛地黄皂苷提取物）的毛地黄皂苷缓冲液重悬浮分离的线粒体。
通过使用微管混合器（以最大速度）或涡流混合器强烈混合悬浮液15分钟。如有必要，加入等体积的MTiso缓冲液以终止洋地黄皂苷的提取。
在10,000×g（10分钟，4℃）离心悬浮液以分离含有丝裂原体（IM +基质）和含有增溶的OM和膜间空间（IMS）蛋白的上清液。
为了分离IM部分和基质部分，将沉淀物（间质体）重悬浮于少量MTiso缓冲液（通常为0.1-0.5ml）中，轻轻超声处理以在装有冰冷的水浴型超声发生器中破坏叶绿体水，然后以100,000×g（30分钟，4℃）离心，得到作为沉淀的IM级分和作为上清液的基质级分。
（可选）如果需要浓缩可溶性蛋白质，请使用三氯乙酸进行TCA沉淀法。

食谱

线粒体分离缓冲液（MTiso缓冲液）
3mM HEPES-KOH（pH7.4） 210mM甘露糖 70mM蔗糖 0.2 mM EGTA
完全迷你无EDTA（蛋白酶抑制剂混合物）
降血脂素储备溶液（新鲜制备）
4％洋地黄皂甙在水中（在60℃加热将改善毛地黄皂苷的不溶性）
去离子蛋白缓冲液（含有0.15-5mg/ml毛地黄皂苷的MTiso缓冲液）
通过混合MTiso缓冲液和digitonin储备液制备缓冲液
注意：毛地黄皂苷提取的效率主要取决于毛地黄皂苷试剂的质量（例如制造和批号）。建议测试几种不同浓度的毛地黄皂苷的效率。在适当浓度下的降钙素提取将清楚地分离OM和丝裂原体，尽管在较高浓度下的治疗不仅将溶解OM而且也溶解IM。

参考文献

Nishimura，N.，Gotoh，T.，Oike，Y.and Yano，M.（2014）。 TMEM65是一种线粒体内膜蛋白。 PeerJ 2：e349。
Pallotti，F。和Lenaz，G。（2007）。线粒体从动物细胞和组织培养系中的分离和亚分级。方法Cell Biol 80：3-44。
Schnaitman，C。和Greenawalt，J.W。（1968）。大鼠肝线粒体内膜和外膜的酶性质。 Cell Biol 38（1）：158-175
Yano，M.，Hoogenraad，N.，Terada，K.and Mori，M。（2000）。人类Tom22蛋白质进入线粒体的鉴定和功能分析 Cell Biol 20（19）：7205-7213
Yano，M.，Kanazawa，M.，Terada，K.，Namchai，C.，Yamaizumi，M.，Hanson，B.，Hoogenraad，N.and Mori，M.（1997）。在具有绿色荧光蛋白的培养的哺乳动物细胞中线粒体蛋白输入的可视化和人类输入的过表达的作用受体Tom20.J J Biol Chem 272（13）：8459-8465。