材料和试剂

通过皮下静脉穿刺获得的100ml外周血
肝素 - 防止血液凝结
Histopaque-1077（Sigma-Aldrich，目录号：10771）或任何等效的ficoll溶液（密度为1.077g/ml）
胎牛血清（FCS）
PBS（冷藏）
DC分离试剂盒（Miltenyi Biotec，目录号：130-094-487）
抗体（BD生物科学，除非另有说明）
1. 抗TCRα/b-FITC（目录号：347773） - 与小鼠IgG 1 -FITC的同种型
2. 抗CD19-FITC（目录号：553785） - 具有IgG 2a-FITC的同种型
3. 抗CD14-FITC（目录号：561712） - 具有IgG 2a-FITC的同种型
4. 抗HLA-DR-PE（目录号：556644） - 具有IgG 2a 2a的同种型
MACS缓冲区（参见配方）

设备

磁激活细胞分选（MACS）磁体
LS柱（Miltenyi Biotec，目录号：130-042-401）
离心机（50ml管容量）
50ml聚丙烯锥形管（Falcon ）
14 ml snap-cap聚丙烯管

程序

单核细胞分离
1. 冷却MACS磁体适配器和LS柱在4°C。 LS列有一个总数负载能力为2×10 9个未纯化的细胞（这将允许分离10 8个标记的细胞）。
2. 在冰上冷却MACS缓冲液和PBS。
3. 在PBS中稀释血液1：1。
4. 向50ml锥形管中加入15ml histopaque-1077（密度1.077g/ml）
5. 小心地在上面层30-35毫升血/PBS。
6. 在室温下以800×g离心20分钟。离心机上无制动。
7. 以WBC为界面。要做到这一点使用巴斯德移液器。挤奶嘴在添加到猎鹰之前，然后吸起白色蓬松基于histopaque的看的层数。避免吸入过多 histopaque-1077，因为它可以防止细胞沉淀
8. 颗粒细胞以300×g离心10分钟（RT）。如果有颗粒细胞的问题可能是由于污染淋巴细胞凋亡，然后再稀释1：4英寸 PBS和重复离心步骤
9. 在冷PBS PBS中洗涤3次，每次10分钟。向沉淀的细胞中加入50ml PBS
10. 计数单元格。可能需要稀释（1：100）。将样品作为FAC分析的预分选控制以确定富集
11. 在300×g离心10分钟（RT）。
12. 在300μlMACS缓冲液中每10 8个总细胞重悬浮沉淀。所以对于3×10 9个细胞，将细胞重悬浮在9ml中。加入100微升的FcR 阻断试剂（在试剂盒中）/10 8和100μlMicrobead树突状细胞抗体混合物
13. 在4℃孵育10分钟。
14. 转移至50ml Falcon并在PBS中洗涤。旋转300 x g 10分钟（RT）
15. 当旋转结束时，对柱充电。
16. 将柱插入物LS柱装入磁体。然后通过柱运行3ml MACS缓冲液。丢弃流过。
17. 将离心的细胞重新悬浮于500μlMACS缓冲液中，每10个 8个细胞，并添加到柱中。
18. 收集流量。将此流量重新应用到色谱柱。再次收集，然后再用3 ml洗柱两次洗涤。流过物代表树突细胞群。
19. 计数单元格。
20. 然后将单元用于下游应用。
FACS染色
1. 使用上面的单元格计数。将10 5个细胞沉淀（400×g/5分钟）在FACs管中并重悬在管中的残余PBS中（约50μL） μl）。
2. 加入1微升正常小鼠血清的细胞，孵育10分钟（RT）
3. 直接进行直接添加抗体到细胞（或同种型匹配的对照）。污点存在正常血清。在室温下在黑暗中染色20分钟（除非IgM 然后在+ 4℃下进行）。有一个管未设置参数收集。
4. 在10x PBS中洗涤细胞，然后旋转（400×g; 5分钟，RT）。重悬在500微升，并进行FACs分析。
5. 细胞的特征在于表达一组细胞表面与DC表型一致的标记。细胞应该是HLA-DR ^高，而TCR，CD14和CD19阴性。细胞还将表达CD1a， CD86和CD83 ^低。

代表数据

图1.在histopaque 1077上分离PBMC

图2.在分离后显示为HLA-DR阳性且CD14,19和TCRα/β阴性的假定DC的FAC分析

食谱

MACS缓冲区
补充有0.5％胎牛血清和2mM EDTA的PBS

参考文献

Reeves，M. B. and Sinclair，J. H.（2013）。从健康血清阳性供体分离的循环树突细胞是人巨细胞病毒再活化的位点， 613> 87（19）：10660-10667。