材料和试剂

EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：E9884）
Tris-HCl（Sigma-Aldrich，目录号：T5941）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T8787）
DL-二硫苏糖醇（DTT）（Sigma-Aldrich，目录号：43815）
蛋白酶抑制剂混合物，例如完全无EDTA蛋白酶抑制剂片剂（Roche Diagnostics，目录号：11873580001）
L-鸟氨酸单盐酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：O2375）
酸处理的[14 C] -L-鸟氨酸（100μCi/ml，40-60mCi/mmol）（PerkinElmer，目录号：NEC710050UC）
吡哆醛5'-磷酸一水合物（PLP）（Sigma-Aldrich，目录号：82870）
柠檬酸（Sigma-Aldrich，目录号：C0759）
SOLVABLE（PerkinElmer，目录号：6NE9100）
[表1] [注释1] [注1] [注释1] [乙酰辅酶A]（AcCoA）（20μCi/ml，40-60mCi/>
亚精胺三盐酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：S2501）
盐酸羟胺（Sigma-Aldrich，目录号：159417）
ddH sub 2 O
96％乙醇，例如ETAX A（Altia Oyj，目录号：12210143）
液体闪烁混合物，例如OptiPhase HiSafe 2（PerkinElmer，目录号：1200-436）
缓冲区A（参见配方）
1 M Tris-HCl（参见配方）
200mM EDTA（pH 8.0）（参见配方）
100 mM DTT（参见配方）
酸处理的[14 C] -L-鸟氨酸（参见配方）
10 mM或25 mM L-鸟氨酸（参见配方）
20 mM PLP（参见配方）
2 M柠檬酸（见配方）
100 mM Spd（参见配方）
1 M羟胺（参见配方）

设备

10毫升带橡胶帽的玻璃管（注2）
玻璃管管架
Whatman ^TM 3MM Chr色谱纸（Thermo Fisher Scientific，目录号：05-713-336）
注意：切割成3厘米x 2厘米大小，折叠4次（图1A）。
长18-21G针
10毫升注射器
镊子
组织匀浆器，例如3-ml Potter-Elvehjem玻璃管和杵（Sigma-Aldrich，目录号：P7734）和操作研杵的钻子
0.5 ml微量离心管
微量离心机
带有块的热循环仪适用于0.5 ml管
Whatman？sup？Grade P81离子交换纤维素色谱纸（Thermo Fisher Scientific，目录号：05-171-2A）（切成1.5×1.5cm大小）
Parafilm TM（Sigma-Aldrich，目录号：P7793）
水平振动器
一张滤纸
Wallac 4-ml塑料闪烁小瓶和盖（PerkinElmer，目录号：1200-421）
液体闪烁计数器和适用于4-ml小瓶的平板

程序

样品制备
1. 细胞或组织样本
  1. 单元格样本
    重悬细胞沉淀冰冷的缓冲液A通过吸移上下，直到细胞悬浮液同质的; 将样品保存在冰上（注3，注4）
  2. 组织样品
    称重组织并在冰上匀浆至2-3x体积的缓冲液A，通过使用 Potter-Elvehjem匀浆器或其他合适的匀浆器（注3-4）。例如，使用100mg组织和200-300μl缓冲液A.均化样品直到没有组织块残留。转移匀浆干净的微量离心管。
2. 在冰上孵育管子20分钟。
3. 在+ 4℃下以15,000×g离心30分钟
4. 将上清液转移到干净的微量离心管中，弃去沉淀。将样品保存在冰上。

ODC活性测定

计算所需的管和反应混合物的量。每个样本应重复测定。还包括两个空白反应和两个 "总计数"（用于确定反应中的总放射性）混合物）。
标记所需数量的玻璃管，并将其装入管架。将机架放在冰水浴上。

在冰上制备反应混合物（表1）
表1.用于ODC活性测定的反应混合物（一个反应）

组件	金额
1 M Tris-HCl（pH 7.4）	25μl
200 mM EDTA	5微升
100 mM DTT	10微升
10 mM或25 mM L-鸟氨酸（注5）	10微升
100μCi/ml [14 C] -L-鸟氨酸	2微升
20 mM PLP	5微升
ddH sub 2 O	143μl
总计	200μl

将200μl反应混合物小心地移至试验底部管，注意不要用移液管尖端接触管壁（注6）。
将50μl样品或空白（缓冲液A）加入试管底部
移取25μl溶于3MM折叠纸（注7），放入玻璃管的顶部，并用橡胶帽密封（图1B）。
孵育管（直立）在+37°C水浴温和摇动30分钟（组织样本）或60分钟（细胞样本）。
将管架放回冰水浴上。
在通风橱中，加入1ml的2M柠檬酸的壁管通过使用长的18-21G针连接到10ml注射器（注2，注8）（图1C，D）。
继续在+37°C水浴孵育，温和摇动15分钟。
将折叠的纸放入4毫升闪烁瓶使用镊子（也见图2C）。
还包括两个"总计"小瓶 - 移液器100μl的反应混合物倒入折叠的纸中，并将其放入闪烁瓶中
向每个小瓶中加入3ml闪烁鸡尾酒，并用盖子封闭（参见图2D-E）
用液体闪烁计数器测量[14 C] - 放射活性（注9）。
计算结果（另请参见表3）：
1. 检查[^{标记的L-鸟氨酸：
  标记的放射性c（mCi/ml）/比活性（mCi/mmol）
  标记为 = 标记为的_标签 n _总 = n _已标记 + n未标记的}
2. 接下来计算多少cpm对应于1pmol的L-鸟氨酸：
  相对比活性（RSA）（pmol/cpm）= n总计/[（平均"总计数"cpm）* 2]
3. 然后计算结果：
  1. 对于单元格
    [（平均样品cpm-平均空白cpm）* RSA] /（每50μl样品的mg蛋白质）= pmol/h/mg蛋白质
  2. 对于组织
    {[（平均样品cpm-平均空白cpm）* RSA] /（每50μl样品的mg蛋白质）}/0.5 h = pmol/h/mg蛋白质
    活性可以表示为每mg蛋白质，磨。细胞，μgDNA或mg组织。
对于组织和细胞样品，当cpm值超过〜15,000时通常需要稀释样品

图1. ODC活性测定。A.折叠的Whatman 3 MM滤纸。乙。 ODC反应管，折叠纸就位。 C.停止反应加入2M柠檬酸，使用可针刺的橡胶帽和D普通橡胶帽。

SSAT活性测定

计算所需的管和反应混合物的量。每个样本应重复测定。还包括两个空白反应和两个 "总计数"，用于确定反应中的总放射性混合物
标记所需量的0.5 ml微量离心管，并将其放在冰上

在冰上制备反应混合物（表2）。

表2. SSAT活性测定的反应混合物（一个反应）

组件	金额
1M Tris-HCl（pH7.8）	10微升
100 mM Spd	3微升
100 mM DTT	1微升
（20μCi/ml）[14 C] -AcCoA 6	2.5μl
ddH sub 2 O	73.3微升
总计	90微升

吸取90微升反应混合物到每个管。
吸取10μl样品或空白（缓冲液A）到每个管
在+ 37℃下在热循环仪中孵育10分钟（注10）。
冷却至+4℃，加入20μl的1M羟胺
在+100℃下加热3分钟。
在RT下以15,000×g离心管5分钟
将P81纸方格放置在石蜡膜上，并用铅笔将其编号（图2A）
吸取40μl样品上清液到每个纸方块，并让其干燥。还包括两个"总计数" - 移液45μl反应混合物以过滤纸。
将"总数"纸张正方形放入使用镊子的4-ml闪烁小瓶，加入3ml闪烁鸡尾酒，并用盖子封闭它们（图2C-E）
将样品和空白纸方格放在1升锥形烧瓶中。
用dH 2 O洗涤纸张方格3×5分钟和1×10分钟（500ml 每次洗涤），在约200rpm下在水平振荡器上摇动（注释11-12）（图2B）。
用400 ml 96％乙醇洗涤纸张方格5分钟，在水平振荡器上以约200 rpm振摇（注释11）。
将纸张正方形用乙醇倒入一个大容器中，用镊子将它们放在一张大张滤纸上，然后让其干燥。
将纸方格放入4毫升闪烁瓶（图2C）。
添加3毫升闪烁鸡尾酒到每个小瓶，用盖子关闭它们（图2D-E）
用液体闪烁计数器测量[14 C] - 放射活性（注9）。
计算结果（也见表3）：
1. 检查[14 C] -AcCoA批次标记的比活性，并计算其在反应混合物中的摩尔量（90μl）：
  c =放射性c（mCi/ml）/比活性（mCi/mmol）
  n = c * V
2. 接下来计算多少cpm对应于一个pmol的AcCoA：
  相对比活性（RSA）（pmol/cpm）= n/[（平均"总计"cpm）* 2]
3. 然后计算结果：
  {[（平均样品cpm-平均空白cpm）* RSA] *（120μl/40μl）/（每10μl样品的mg）} * 6 = pmol/h / 活性可以表示为每mg蛋白质，磨。细胞，μgDNA或mg组织。
对于组织和细胞样品，当cpm值超过〜6,000时通常需要稀释样品

图2. SSAT活性测定和制备液体样品闪烁计数。 A。编号为P81纸方格的样品，空白和总计数。 B.洗纸方格。 C.放置纸方格到液体闪烁瓶。 D.添加闪烁鸡尾酒与分配器。 E.加盖和未加盖的小瓶和盒盖。

代表数据

表3.来自使用DU145细胞的实验的代表性数据

笔记

AcCoA非常不稳定。解冻包装后，分装并储存在-20°C
建议使用可用针刺穿的橡胶帽，以避免任何可能的放射性CO 2从管中释放。
细胞/组织可以是新鲜的或冷冻在-70℃
所用缓冲液的量取决于特定细胞/组织类型中的ODC/SSAT活性。所需的澄清裂解物的量为SSAT测定为20μl，ODC测定为100μl。我们建议使用至少40毫克的组织和至少0.5磨。细胞/200μl缓冲液
对于细胞样品使用10mM L-鸟氨酸，对组织样品使用25mM L-鸟氨酸
当移液到管的底部时，超长移液管吸头是方便的。出乎意料的高cpm值通常是由玻璃管壁上的污染反应混合物引起的
可溶的吸收释放[^{14 C] -CO 2 。}
请勿用针接触纸张，否则将会释放[¹⁴ C] -CO ₂。如果使用普通的橡胶帽，只需稍微打开它，以便将针安装到管中，并在添加柠檬酸后立即关闭帽。
为了获得最佳结果，在测量前将小瓶置于室温下
反应可以方便地在热循环仪中进行，但也可以在水浴或加热块上进行
振动速度取决于振动器的尺寸。使用速度，使纸方格轻轻地围绕烧瓶。太高的速度将导致从方角上的纸张丢失。
高空白值（> 500cpm）表示在同一烧瓶中洗涤不足或样品量太高。或者使用两个烧瓶来洗涤纸方格，或者用H 2 O添加另外两个5分钟的洗涤。
Triton X-100对于组织样品不是绝对必要的，但它增强了细胞破裂
[14 C] -L-鸟氨酸的商业制剂含有可变量的放射性CO 2，这将导致高空白值。酸处理除去任何残留的放射性CO 2（Jänne和Williams-Ahsman，1971）。

食谱

缓冲区A（注13）
将1.25ml Tris-HClpH7.4,250μl200mM EDTA pH8.0,50μlTriton X-100和500μl100mM DTT混合
将ddH 2 O加到最终体积为50ml的
中将一片完全无EDTA的片剂溶解在溶液中
等分并存储在-20°C
1 M Tris-HCl（pH 7.4或pH 7.8）
将157.6g Tris-HCl溶解于〜800ml ddH 2 O中
用NaOH调节pH至7.4或7.8 将ddH <2> O加入到最终体积为1000ml
过滤灭菌（0.2μm）
存储在RT
200mM EDTA（pH8.0）称取58.448g EDTA至〜800ml ddH 2 O 2 / 用NaOH缓慢调节pH至8.0 - 当pH接近8时，EDTA溶解。
将ddH <2> O加入到最终体积为1000ml
过滤灭菌（0.2μm）
存储在RT
100 mM DTT
在通风橱中将1.5425g DTT溶解于ddH 2 O中，最终体积为100ml。
过滤灭菌（0.2μm）
等分并储存在-20°C
酸处理的[14 C] -L-鸟氨酸（注14）
将0.5ml [14 C] -L-鸟氨酸与1ml 0.1M HCl混合
在通风橱中的旋转蒸发器中蒸发至干将残留物溶于0.5ml 0.01M HCl中等分并储存在-20°C
10mM或25mM L-鸟氨酸在终体积100ml中将168.62mg或421.55mg L-鸟氨酸盐酸盐溶解于ddH 2 O中，分别得到10mM或25mM浓度。
过滤灭菌（0.2μm）
等分并储存在-20°C
20 mM PLP
将530.32mg吡哆醛5'-磷酸一水合物溶解于ddH 2 O至最终体积为100ml
过滤灭菌（0.2μm）
等分并储存在-20°C
2 M柠檬酸
将384.24g柠檬酸溶解于ddH 2 O至最终体积为1,000ml
过滤灭菌（0.2μm）
储存在+4°C
100 mM Spd
将2.546g Spd溶解于ddH 2 O至最终体积为100ml。
过滤灭菌（0.2μm）
等分并储存在-20°C
1 M羟胺
将6.949g盐酸羟胺溶解于ddH 2 O至最终体积为100ml。
过滤灭菌（0.2μm）
存储在RT

致谢

这项工作得到了东芬兰大学和芬兰科学院的战略资助。协议从Jänne和Williams-Ashman（1971）和Libby（1978）开发的原始版本修改。

参考文献

Jänne，J。和Williams-Ashman，H.G。（1971）。关于从大鼠前列腺中纯化L-鸟氨酸脱羧酶和硫醇化合物对酶的影响。/b> J Biol Chem 246（6）：1725-1732。
Libby，P.R。（1978）。小牛肝核N-乙酰转移酶。具有亚精胺乙酰转移酶和组蛋白乙酰转移酶活性的两种酶的纯化和性质.J Biol Chem 253（1）：233-237。