材料和试剂

胚胎海马神经元（E18）
SynaptopHluorin
注意：基于pHluorin的融合蛋白，其中黄体pHluorin融合到突触结合蛋白的腔内环（Fernandez-Alfonso和Ryan，2006; Wienisch和Klingauf，2006）
0.03％胰蛋白酶（-20℃）（Sigma-Aldrich）
0.1％（w/v）聚-L-赖氨酸（-20℃）（Peptides International）
神经基础培养基（2-8℃）（Life Technologies，Gibco ）
B-27（-20℃）（Life Technologies，Gibco ）
谷氨酰胺（终浓度：0.5mM，-20℃）（Life Technologies，Gibco ）
谷氨酸（终浓度：0.025mM）（Sigma-Aldrich）
胎牛血清（FBS）（-20℃）（Life Technologies，Gibco ）
Fluo-4AM钙指示剂（-20℃）（Life Technologies，Molecular Probes ，目录号：F14201）
DL-2-氨基-5-膦酰基戊酸（APV）（终浓度：50μM，4℃溶液）（Sigma-Aldrich，目录号：A5282）
6-氰基-7-硝基喹喔啉-2,3-二酮（CNQX）（终浓度：10μM，-20℃）（Sigma-Aldrich，目录号：C127）
Bafilomycin A1（终浓度：5μM，20℃）（Calbiochem ，目录号：196000）
真空润滑脂（Dow-Corning，用于安装盖玻片）
HEPES缓冲盐水（HBS）细胞外溶液（4℃）（参见配方）
2x HeBS（请参阅配方）

设备

巴斯德移液器
1号，12mm直径的玻璃盖玻片（Warner Instruments）
注意：1号玻璃盖玻片用HCl和乙醇洗涤，然后高压灭菌。将高压灭菌的玻璃盖玻片在0.1％（w/v）聚-L-赖氨酸中处理过夜。聚-L-赖氨酸在第二天吸出，玻璃盖玻片用无菌水洗涤三次。
倒置显微镜（63x油浸镜头，汞弧灯，EGFP过滤器）（ZEISS）
带延时成像系统的计算机
电场刺激室（两个平行的铂丝电极电极）（Warner Instruments）
灌注泵（Ismatec REGLO Digital 2-Ch Var-Speed Pump; 0.005至59ml/min）（Cole-Parmer，目录号：WU-78016-40）

软件

Axiovision LE软件
Microsoft Excel

程序

大鼠海马神经元的原代培养物
如先前所述（Krueger等人，2003; Kaech和Banker，2006; Li等人）从大鼠胎儿（Sprague-Dawley，妊娠的第18天; Harlan，Indianapolis，IN）制备原代大鼠海马神经元; 等，2008a，b; Beaudoin等人，2012; Park等人，2014）。使用高压灭菌工具从产前脑中分离海马后，将它们与0.03％胰蛋白酶孵育12分钟。海马神经元通过研磨通过无菌抛光的巴斯德吸管分离。将神经元接种在含有含5％FBS的培养基的平板上。孵育3小时后，将细胞维持在补充有B-27，谷氨酰胺和抗生素的神经基础培养基中。神经元在37℃下在5％CO 2和20％O 2加湿培养箱中生长。在铺板后第5天用2.5M磷酸钙转染神经元，效率为1-5％。简言之，如下制备转染混合物溶液，并在室温下温育20分钟：将15μlH 2 O，1.8μl2.5M CaCl 2，1.5μgcDNA ，和15μl的2x HeBS（对于具有500μl培养基的12孔板的孔）。将鸡尾酒溶液加入到已经存在于孔中的细胞培养基中并孵育30分钟。然后在洗涤三次后用条件培养基替换该转染培养基
1. 解剖胚胎海马神经元（E18），然后与0.03％胰蛋白酶孵育12分钟。
2. 通过抛光的巴斯德吸管研磨使海马细胞解离。
3. 将神经元接种在0.1％（w/v）聚-L-赖氨酸包被的12-mm上直径的盖玻片，密度为5×10 4个细胞/每个孔孔板;这是相对低的密度能够看到神经元处理
4. 细胞在补充的Neurobasal培养基中培养与1x B-27（它被排序为50x，但最后是1×10毫升在500毫升 Neurobasal培养基），0.5mM谷氨酰胺，25μM谷氨酸和5％FBS。
5. 铺板后3小时，用补充有B-27和0.5mM谷氨酰胺的无血清Neurobasal替换培养基。
6. 培养物通常包含少量胶质细胞，开始形成突触 6天后在体外，并且通常用于突触研究16至 21天后。
在培养的海马神经元中表达SynaptopHluorin 磷酸钙（Jiang和Chen，2006）方法用于用每孔1.5μgDNA的SynaptopHluorin转染DIV 4或5上的海马神经元。
转染效率约1-5％（见图1）。转染在DIV 5进行。神经元在DIV 16-21成像

图1。表达GFP-标记的线粒体蛋白的健康神经元的磷酸钙转染实例显示相位对比A，绿色荧光B和合并的图像C. Bar = 20μm
准备刺激
1. 盖玻片用真空油脂安装在电场刺激室中（见图2）。
2. 立即加入50μlHBS以覆盖神经元和铂电线。密封件应足够紧以防止泄漏。
3. 在室温下以2ml/min的速率灌注室 HBS溶液，含有10μMCNQX，50μMAPV以预防复发活性。
4. 所有实验在室温下进行，但可以使用生理温度。
图2。记录室的图像。带有插入盖玻片A的记录室，以及显微镜B上盖玻片的方向图。
刺激
1. 使用EGFP的激发和发射滤光片定位健康的表达SynaptopHluorin的神经元。
  注意：重要的是选择没有很高的突触休息荧光的水平，因为明亮的突触倾向于代表不健康细胞的轴突或高度过表达SynaptopHluorin的细胞分子在细胞表面。
2. 在刺激之前，重要的是固定曝光时间并在计算机上设置延时图像程序。
  注意：
  1. 曝光时间应足够长，以具有重要的像素强度和短到足以限制显着的光漂白。在我们的实验中，我们使用曝光时间不超过100毫秒。
  2. 漂白应该最小化，以便没有必要纠正漂白。如果漂白是明显的，控制应该在没有刺激的情况下执行以估计漂白率来校正数学上用于漂白的最终数据
3. 至少三个图像必须在刺激之前获得足够的数据点以确保稳定的基线荧光（图3）。时间然后从中获得荧光SynaptopHluorin反应的过程每3秒拍摄一次延时图像（图3）。
4. 以下基线成像，用5Hz下的100个刺激刺激神经元（50 mA，1ms脉冲）20秒（图3）。这应该耗尽可释放池，并开始使用更缓慢释放的池。简要刺激对海马神经元工作更好。我们建议从a开始低电流脉冲并逐渐增加电流直到最佳获得刺激效果。等待至少一分钟，然后重复刺激，因为突触需要在每次刺激后恢复。还有，成熟神经元形成最完整的突触连接，所以如果有一点反应是有帮助的使用老的文化。
  注意：
  1. 根据我们的经验，16-21天的海马神经元在a 密度5×10 ⁴ 细胞/12孔板的孔是实验。
  2. 检查成熟度的另一种方法细胞是使用fluo-4 AM钙指示剂。神经元加载5 μMfluo-4AM（最终）并在37℃在黑暗中孵育30分钟。荧光灯轴突静脉曲张对应于沿海马的突触boutons 在培养的神经元的相图像中检测到的细胞轴突（Komai et et al。，2006）。然后在5Hz下刺激神经元（50mA，1ms）20 秒。测量指示剂的荧光响应的时间过程从每3秒拍摄的延时图像。如果神经元有一个对fluo-4 AM的强烈响应，这预示着未来的成功使用 SynaptopHluorin。
5. 在使用SynaptopHluorin的刺激期间，在刺激期间和刺激之后获得图像共120秒。
6. 静息5分钟后，可刺激神经元在5μMbafilomycin A1存在下在HBS中再次在5Hz下进行20秒。神经元应该至少坐30秒以允许巴佛洛霉素A1扩散进入细胞。 bafilomycin暴露后，荧光会来到a 甚至在刺激结束后的高原和这个峰值荧光值将被用作荧光强度的绝对最大值。
图3. 突触点荧光随时间变化的实例图。显示了5个样品的荧光值相对于基线的变化。对于5个样品，荧光斑点的荧光斑点的图像是针对在5Hz下用100个刺激物刺激的两个细胞（对照和过表达Bcl-xL的细胞）获得的。每个细胞在刺激之前，期间和之后。恢复到基线的时间过程可以通过拟合曲线到数据的恢复部分来测量
图像分析
1. 一般来说，表达具有高基线的SynaptopHluorin的轴突荧光不能产生显着的荧光增加刺激。这些神经元具有异常高的表面表达突触蛋白因此应该避免使用这些突触。重要的是选择合适大小的感兴趣区域（ROI）。 SynaptopHluorin扩散在轴突的质膜内远离突触前bouton刺激增加荧光面积（Li和Murthy，2001）。如果ROI太小，它不会包括这种横向运动，因此你不会看到适当的荧光变化。因为a的平均直径 bouton约1-2微米，SynaptopHlourin的横向运动与中心点的距离相等（Li和Murthy，2001）个体bouton的ROI的理想尺寸为约4μm2（Granseth等人，2006）。每个ROI的平均荧光信号测量所有图像的固定尺寸（参见图4）。图像J也可以用于分析。所有荧光信号减去背景使用与相似大小的单元格相关的ROI
  
  图4。 SynaptopHluorin斑点的证明。示例显示了三个不同时间的荧光测量，由黄色箭头指示。 ROI（红色框）的示例显示在顶行，并且为了清楚起见，在第二行中重复这些图像而没有红色框。 Bar =5μm
2. 荧光值对于基线值通过平均3个静止图像来获得刺激期。荧光反应的时间过程 SynaptopHluorin是从每3秒拍摄的延时图像测量的。使用Axiovision LE软件（或Image J）和 Microsoft Excel。
3. 响应a的斑点的荧光变化刺激（ΔF）= F-F 0（F =每个ROI的实际荧光，F 0）：初始荧光强度，其是刺激前的荧光）。按顺序标准化SynaptopHluorin斑点的荧光变化ΔF/F O 以查看电刺激之前，期间和之后的差异注意：
  1. 如果图像在时间过程中横向移动，则会有或者时间过程将不准确。实际上基线荧光值在个体突触中变化约10％在第一和第二组刺激之间。绝对（非标准化）静息（基线）荧光未淬灭的SynaptopHluorin分子在质膜上。数量的未淬灭的SynaptopHluorin荧光可以在任何突触，特别是在不同神经元之间。为此，测量绝对基线荧光可更好地表示实际数据。这些数据应与出版的手稿一起显示归一化数据。
  2. 如何防止选择突触的偏见？做随机分析，做至少3个不同的文化（使同样标准培养每次），对照组和实验组盲法到实验条件。检查所有图像以确保它们没有移动，非常稳定。不要选择明亮的突触; 建立正确的ROI大小和随机选择boutons做分析。尝试平均所有记录，你做的分析越多，越好表示突触的平均行为和较少通过选择过程的偏差的可能性。
  3. 什么类型你看到的工件？有时你会看到荧光的变化刺激后不恢复的刺激停止。这可能由SynaptopHluorin的异常高表面表达引起可能发生在不健康的细胞中。一些突触从来没有出现响应。这可以表示荧光位于检测之下的bouton 阈。有不同的囊泡检索模式突出取决于突触的类型。在我们的海马图像使用SynaptopHluorin难以辨别这些不同的模式。 SynaptopHluorin分子是移动的和横向扩散荧光从胞吐位点到bouton的其他部分可能会导致分析中的工件。调查员可能想考虑使用突触泡蛋白-pHluorin，其具有较低的迁移率 SynaptopHluorin。此外，互动之间紧密相连荧光斑点可以扰乱荧光水平刺激。应该从分析中省略显示这些的点工件。
  4. 因为SynaptopHluorin分子是移动的，有时我们可以看到SynaptopHluorin扩散出来的小 ROI导致信号的快速下降。这构成了一个工件并且与胞吞作用无关。要克服它，选择一个较大的ROI面积以防止显着的扩散损失 synaptopHluorin。

食谱

HEPES缓冲盐水（HBS）细胞外溶液
119 mM NaCl
2.5mM KCl
2mM CaCl 2 2 / 2mM MgCl 2/
25 mM HEPES
30mM葡萄糖缓冲至pH 7.4
使用前温度升至室温
2x HeBS
274 mM NaCl 10 mM KCl
1.4mM Na 2 HPO 4 SubO 2 .7H 2 O 2。 15mM葡萄糖 42 mM HEPES

致谢

方法改编自（Li等人，2013）。技术也改编自所有引用的参考文献。作者希望感谢Miesenbock，G（Miesenbock等人，1998）为这些研究提供synaptopHluorin构建体。这项工作得到了NIH NS064967授予EAJ的支持。

参考文献

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Fernandez-Alfonso，T.and Ryan，T.A。（2006）。突触囊泡循环在中枢神经系统突触的效率。趋势Cell Biol 16（8）：413-420。
Granseth，B.，Odermatt，B.，Royle，S.J.and Lagnado，L。（2006）。网格蛋白介导的胞吞作用是海马突触小泡检索的主要机制。 Neuron 51（6）：773-786。
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