材料和试剂

XL10-Gold Kanr Ultracompetent细胞（Agilent，目录号：200317）
RNeasy植物迷你试剂盒（QIAGEN，目录号：74904）
Oligotex mRNA小试剂盒（QIAGEN，目录号：70022）
CytoTrap双杂交系统（Agilent，目录号：200444）
酵母转化系统2（Takara Bio Company，Clontech，目录号：630439）。
AccuScript（Agilent，目录号：200820）
RNase H（New England Biolabs，目录号：M0297S）
DNA聚合酶I（New England Biolabs，目录号：M0209S）
UltraPure TM酚：氯仿：异戊醇（25:24:1，v/v）（Life Technologies，目录号：15593-031）
T4连接酶（New England Biolabs，目录号：M0202S）
T4多核苷酸激酶（New England Biolabs，目录号：M0201S）
Xho I（New England Biolabs，目录号：R0146M）
酸洗玻璃珠（Sigma-Aldrich，目录号：G8772）
TritonX-100（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP151-100）
十二烷基硫酸钠（SDS）（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP166-100）
氯化钠（NaCl）（J.T.Baker ，目录编号：JT3628-1）
Tris（J.T.Baker ，目录号：JT4109-1）
EDTA（J.T.Baker ，目录号：JT8993-1）
酵母提取物（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP9727-500）
蛋白胨（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP9725-500）
葡萄糖（J.T.Baker ，目录号：JT1919-1）
硫酸腺嘌呤（Sigma-Aldrich，目录号：A2545）
无氨基酸的酵母氮源（BD，目录号：291940）
DO补充-His/-Leu/-Trp/-Ura（Takara Bio Company，Clontech，目录号：630425）
组氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：H6034）
色氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：T0254）
半乳糖（Sigma-Aldrich，目录号：G0750）
棉子糖（Sigma-Aldrich，目录号：R0250）
酵母裂解液（见配方）
YPDA/YPAD（请参阅配方）
SC/-LU（葡萄糖）（参见配方）
SC/-LU（半乳糖）（参见配方）
10x STE缓冲液（参见配方）

设备

复制电镀模具（Sunrise Science Products，目录号：3005-002）
无RNase的微量离心管（BioExpress，目录号：C-3262-2）
微量离心机（Eppendorf，目录号：5424）
Shaker（New Brunswick Scientific，目录号：M1299-0092）
孵化器（VWR International，目录号：414005-128）
150-mm板（VWR International，目录号：25384-326）
PCR热循环仪（Eppendorf，目录号：6321 000.515）

程序

构建和测试bait-hSos融合蛋白
1. 将编码诱饵蛋白的DNA克隆到pSos载体中（质粒图： http：//www .chem-agilent.com/pdf/strata/217438.pdf ）酶连接法。通过DNA确认质粒构建体测序以确保hSos和诱饵之间的正确阅读框。
2. hSos诱饵应测试自动激活或与之交互在CytoTrap双杂交筛选之前的肉豆蔻酸化信号（Aronheim等人，1997）。
  1. pSos诱饵质粒需要共转化进入酵母宿主细胞cdc25H与阴性对照pMyr或 pMyr-Lamin C，使用Yeastmaker ^TM酵母转化系统2.
  2. 所有酵母培养程序需要在室内进行温度（22-25℃）。共转化后，酵母细胞被扩散在不含亮氨酸和尿嘧啶（SC/-LU）的合成培养基平板上葡萄糖，并在室温下孵育4-5天以允许酵母殖民地生长。
  3. 挑取并放置六个独立的菌落在含有半乳糖的SC/-LU培养基平板上，并保持平板室温下1小时，然后转移至36℃3至6天用于酵母生长
    1. 如果酵母细胞与测试诱饵质粒和空pMyr或pMyr-Lamin C能够在 36°C，则将被认为不适合于CytoTrap双杂交系统。
    2. 只有诱饵质粒不导致宿主的生长酵母细胞在36℃的共转化试验中可能适用使用CytoTrap双杂交系统的交互伙伴的屏幕。
生成CytoTrap双杂交cDNA文库
可以使用来自各种生物体的mRNA构建CytoTrap双杂交cDNA文库。这里我们使用来自模拟植物拟南芥的mRNA作为实例。简言之，从野生型拟南芥植物（Col-0）的叶组织中提取和纯化mRNA，然后使用含有寡核苷酸引物的杂交寡核苷酸（dT）接头引物合成第一链cDNA， em> Xho I限制性位点和高保真逆转录酶。在合成第一链cDNA期间使用5-甲基dCTP代替常规dCTP，并且所得cDNA中的甲基化Xho I位点将对Xho I消化是有弹性的。使用DNA聚合酶I合成第二链cDNA。含有粘性EcoR I末端和平端（参见注释1中的序列）的衔接头与抛光的双链cDNA连接，然后cDNA用Xho I消化。将所得的在5'端含有Eco RI并在3'端含有Xho I的cDNA连接到通过Eco RI预切割的pMyr载体中，因此cDNA以由Gal1启动子（P GAL1 ）驱动的有意义的表达取向插入。 cDNA文库携带在pMyr质粒中（质粒图： http://www.chem-agilent.com /pdf/strata/217438.pdf ）然后转化为高效率的E。大肠杆菌 XL10-Gold Kan细胞用于繁殖和储存。详细过程如下所述。
cDNA合成：
1. mRNA纯化。来自4周龄拟南芥Col-0的叶样品（〜2g）收获植物，从叶组织提取总RNA 使用RNeasy Plant Mini Kit。然后从1mg的纯化的聚（A）mRNA纯化总RNA，使用用于cDNA合成的Oligotex mRNA Mini试剂盒（Zhang et al al。，2014）。
2. 第一链cDNA合成使用高保真逆转录酶AccuScript进行
  1. 将以下试剂加入无RNase的微量离心管中：
    10×第一链缓冲液：5μl
    第一链甲基核苷酸混合物：3μl
    接头 - 引物（1.4μg/μl）：2μl
    核糖核酸酶核糖核酸酶抑制剂（40 U /μl）：1微升
    mRNA：等于5μg
    DEPC处理的水：将体积调至50μl
  2. 在室温下孵育反应10分钟以使引物与模板退火
  3. 加入3微升AccuScript逆转录酶的反应，孵育反应在42℃下2小时。
3. 第二链cDNA合成
  1. 将第一链cDNA反应管置于冰上，并向管中加入以下试剂：
    10x第二链缓冲液：20μl
    第二链dNTP混合物：6μl
    无菌ddH 2 O：139μl
    核糖核酸酶H（5U /μl）：1μl
    DNA聚合酶I（9.0U /μl）：11μl
  2. 轻轻混合反应物并旋转反应。
  3. 在16℃孵育3小时，然后将管置于冰上。的得到的双链cDNA（ds cDNA）应该适合适配子结扎。
4. 使cDNA末端平齐并连接EcoR I接头
  1. 加入以下试剂至第二链cDNA合成，并在72℃孵育30分钟。
    10mM dNTP混合物：4μl
    DNA聚合酶（NEB）：4μl
  2. 加入200μlUltraPure TM苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）到反应并涡旋混合。在室温下将反应物在14,000×g下旋转5分钟，然后转移上层（〜200 μl）至新管。
  3. 加入200μl氯仿并涡旋。向下旋转在14,000×g下在室温下反应5分钟，然后转移上层（〜200微升）到一个新的管。
  4. 加入以下试剂沉淀cDNA，涡旋并保持反应在-20℃过夜。
    3 M乙酸钠：20μl
    100％（v/v）乙醇：400μl/
  5. 在4℃下在14,000×g下旋转cDNA，持续60分钟。
  6. 小心除去上清液，用70％乙醇（v/v）。在室温下以14,000×g离心沉淀2分钟温度。取出乙醇，在室温下干燥沉淀。
  7. 将沉淀重悬于8μlEcoR I接头中，并在4℃下孵育1小时以确保cDNA的完全溶解。
  8. 将以下试剂加入具有cDNA和Eco RI衔接子的管中使体积达到10μl，并在16℃下孵育反应物过夜。
    10×T4连接酶缓冲液（NEB）：1μl
    T4连接酶（NEB）：1μl
  9. 孵育管在70℃下30分钟终止反应。
5. 磷酸化Eco RI末端。
  1. 在室温下将反应冷却10分钟
  2. 将以下试剂加入试管中，并在37℃孵育1小时。
    10x反应缓冲液（NEB）：1μl
    无菌ddH 2 O：8μl
    T4多核苷酸激酶（NEB）：2μl
  3. 将管在70℃下孵育30分钟以终止反应
  4. 将反应在室温下冷却10分钟，然后加入以下试剂加入到反应中，在37℃下孵育3小时 10x反应缓冲液（NEB）：5μl
    无菌ddH 2 O：22μl
    Xho I（NEB）：3μl
  5. 沉淀cDNA通过加入以下试剂到管中，并在-20℃孵育过夜 10x STE缓冲液：5μl
    100％（v/v）乙醇：125μl
  6. 在4℃下在14,000×g下旋转反应60分钟。去除上清并在室温下干燥沉淀。溶解沉淀在100μl无菌ddH 2 O中。
6. 用CHROMA SPIN ^TM + TE-400柱纯化ds cDNA。（如果没有指定，则在室温下进行。）
  1. 通过颠倒柱几次重悬浮凝胶矩阵。去掉顶盖并取下底部的断开端。放置柱在2-ml收集管中
  2. 在700×g离心5分钟，然后取出收集管和缓冲液。
  3. 将柱子放到一个新的收集管，并添加100微升的cDNA样品到凝胶矩阵的顶部表面的中心。
  4. 以700×g离心5分钟，收集含有cDNA（大小> 200bp）的洗脱溶液。
  5. 通过向洗脱的溶液中加入以下试剂沉淀cDNA，并在-20℃冷冻器中温育过夜。
    3 M乙酸钠（pH5.2）：10微升
    冰冷的100％乙醇：250μl
  6. 在4℃下以14,000×g离心30分钟。丢弃上清液，加入360μl70％乙醇，反转数次，然后在4℃下以14,000×g离心5分钟。除去上清液并在室温下干燥沉淀。重悬在5微升的cDNA 无菌ddH 2 O。
7. 将cDNA导入pMyr载体并转化入大肠杆菌。
  1. 通过加入以下试剂建立T4连接反应，在16℃温育过夜。
    10x连接酶缓冲液（NEB）：2.5μl
    重悬cDNA（1μg）：Xμl
    pMyr载体（通过 Eco RI/ Xho I，500ng）：5μl
    T4 DNA连接酶（NEB）：2.5μl
    ddH ₂ O：将音量调到25μl
  2. 将所有连接反应转化至XL10-Gold Kan超级反应体系细胞。根据使用2μl连接反应每次转化制造商的说明。
  3. 平板变换包含氯霉素（25μg/ml）的150-mm LB平板，约50-100 板总数。传播适当的变换量，这样每个板可以具有30,000个菌落。在37℃孵育过夜允许菌落生长。菌落总数应为3 百万。
  4. 每板加入5 ml LB培养基以刮除细菌并使用另外的1ml LB培养基洗涤每个平板。将所有的细菌在一个烧杯中混合，轻轻地混合。等分10 ml细菌培养在15-ml离心管中并储存在-80℃。从每个10ml等分试样中纯化质粒用于CytoTrap双杂交筛选。
筛选CytoTrap双杂交cDNA文库
将诱饵和cDNA文库质粒共转化到温度敏感宿主菌株cdc25H中。将转化反应物在室温下涂布在含有葡萄糖的SC/-LU平板上以使阳性转化体生长，然后将转化体复制到含有半乳糖的SC/-LU平板上，并在36℃温育以选择表达诱饵和潜在的相互作用配偶体基因。进一步分析阳性克隆以确认诱饵特异性蛋白质相互作用。图书馆筛选流程图如图1所示。
1. 将诱饵和cDNA文库质粒共转化到宿主菌株cdc25H中该步骤按照Yeastmaker TM supam Yeast Transformation建议进行系统2手册除了所有的酵母菌培养步骤都必须在室温下进行，除非另有规定降低速率的cdc25H的回复突变。转化反应扩散开 SC/-LU板（150-mm），并保持在室温持续3至4天，直到菌落生长至直径2-3mm。这是理想的在每个板上有〜3,000个菌落，并且有必要在筛选至少100万殖民地。
2. 复制板生长的殖民地含有半乳糖的SC/-LU板（150-mm），并将板留在室温下1小时，然后移至选择温度为36℃，保温3〜6天。含有推定的菌落相互作用的合作伙伴和回复突变体将长大，它是当它们直径为2-3mm时需要拾取菌落在选择期间，并且不等待在选择结束时拾取
3. 挑取在36℃下含有半乳糖的SC/-LU平板上长出的菌落 ℃，并将菌落溶解在25μl无菌dH 2 O中。点5微升的酵母悬浮于四个板：含有葡萄糖和两个SC/-LU的两个SC/-LU 含有半乳糖。孵育一个含有葡萄糖的SC/-LU板一个含有半乳糖的SC/LU板在室温下，另一个两个板在36℃。
  注意：
  1. 如果存在更多的酵母菌落，则培养板的数目应该放大。
  2. 如图1所示，仅在SC/-LU上生长的酵母菌落而不是在36℃含有葡萄糖的SC/LU上作为进一步分析的主要候选人。
  3. 在36℃下在半乳糖和葡萄糖平板上生长的酵母菌落是温度回复突变体，并且它们在选择性的生长温度是由cdc25H突变基因的回复突变引起的野生型基因，因此它们在36℃的生长不是半乳糖依赖性的。
  4. 大部分的假阳性将是温度恢复突变体并且可以通过测试半乳糖依赖性容易地鉴定在36℃生长。
    
    图1. CytoTrap双杂交文库筛选程序。 pSos-诱饵与a共转化到酵母菌株cdc25H中在pMyr中的cDNA文库。在SC/-LU上选择阳性转化体（葡萄糖）平板。然后复制菌落在SC/-LU（半乳糖）平板上并在36℃温育3至6天。在36℃生长的菌落进一步测试半乳糖和诱饵特异性生长以鉴定真实的相互作用克隆。
分析积极互动候选人
来自文库筛选的主要阳性候选物需要进一步测试，以查看相互作用是否是诱饵特异性的，并且需要鉴定猎物基因的性质以进行功能分析。
1. 从阳性候选人隔离猎物质粒。
  1. 在2ml含有葡萄糖的液体SC/-LU中接种阳性酵母候选物，并在30℃振荡2天。
  2. 转移1.5毫升酵母培养物到1.7毫升离心管，并旋转将细胞以14,000×g离心1分钟。取出上清液并加入 200μl酵母裂解液，通过涡旋重悬细胞。
  3. 加将200μlUltraPure TM苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1，v/v）和 0.3g酸洗玻璃珠，每次大力涡旋2分钟样品。
  4. 在室温下以14,000×g离心5分钟，并将顶层转移到新的微量离心管中。加上以下试剂加入每个管中，并将管在-20℃保持30分钟 min。
    3 M乙酸钠（pH 5.2）：20μl
    冰冷的100％乙醇：500μl
  5. 在4℃下以14,000×g离心沉淀10分钟。去除上清液，并用70％乙醇洗涤沉淀。旋转颗粒在14,000×g下在室温下温育5分钟。取出上清液在室温下干燥沉淀。
  6. 在50中重悬沉淀 μl无菌ddH 2 O，然后使用1-2μl酵母质粒DNA进行转化 10-β电感受态大肠杆菌感受态细胞。传播在LB /氯霉素琼脂平板上进行转化反应。置于37℃ 过夜。
  7. 挑取单个菌落并接种 LB /氯霉素液体培养基中37℃培养过夜。净化质粒用于进一步分析。
2. 酵母共转化测试诱饵特异性蛋白质 - 蛋白质相互作用
  1. 用pSos诱饵或pSos空载体将纯化的候选猎物质粒转化到宿主菌株cdc25H中。
  2. 在室温下将转化体接种在含有葡萄糖的SC/-LU上温度4天。拿起三个独立的殖民地并转移到含有葡萄糖的SC/-LU和含有SC/-U的半乳糖平板，在36℃孵育3至6天。
  3. 只有猎物质粒显示特异性地与pSos诱饵，不与pSos空载体相互作用保持用于序列分析。
  4. 通过DNA测序确定cDNA插入物的身份。

笔记

含有内聚EcoR I末端和平端的衔接子序列：
5'-OH-AATTCGGCACGAGG-3'
3'-GCCGTGCTCCp-5'

食谱

酵母裂解溶液（100ml） 2ml Triton X-100 1克SDS
0.58g NaCl
1ml 1M Tris-HCl（pH8.0）
200μl0.5M EDTA（pH 8.0）
使用无菌dH 2 O 2将体积加至100ml 在室温下贮存
YPDA/YPAD（1 L）
10g酵母提取物
20g Bacto 蛋白胨
20g葡萄糖
40mg腺嘌呤硫酸盐
使用无菌dH 2 O使体积为1L，并调节至pH 5.7-5.8。
如果准备板，加入15克琼脂
在121℃高压灭菌20分钟
SC/-LU（葡萄糖，1L） 6.7g无氨基酸的酵母氮源
20g葡萄糖
0.6 g DO补充-His/-Leu/-Trp/-Ura
0.02克组氨酸 0.05 g色氨酸
使用无菌dH 2 O使体积为1L，并调节至pH 5.7-5.8。
如果准备板，加入15克琼脂
在121℃高压灭菌20分钟
SC/-LU（半乳糖，1L） 6.7g无氨基酸的酵母氮源
20g半乳糖 10g棉子糖 0.6g DO补充剂-His/-Leu/-Trp/-Ura
0.02克组氨酸 0.05 g色氨酸
使用无菌dH 2 O使体积为1L，并调节至pH 5.7-5.8。
如果准备板，加入15克琼脂
在121℃高压灭菌20分钟
10×STE缓冲液（1L）
58.44克NaCl
200ml 1M Tris-HCl（pH7.5）
200ml 0.5M EDTA
使用无菌dH 2 O 2将体积加至1L

致谢

该研究由国家科学基金会授予B.W.的1021344号资助。 Poovaiah和中国国家科学基金会授予U1130304给Liqun Du。我们感谢华盛顿州立大学的Lorie Mochel和Ade Snider帮助准备手稿。

参考文献

Aronheim，A.，Zandi，E.，Hennemann，H.，Elledge，S.J.and Karin，M。（1997）。通过检测蛋白质 - 蛋白质相互作用的新方法分离AP-1阻遏物。 Mol Cell Biol 17（6）：3094-3102。
Li，N.，Batzer，A.，Daly，R.，Yajnik，V.，Skolnik，E.，Chardin，P.，Bar-Sagi，D.，Margolis，B.and Schlessinger，鸟嘌呤核苷酸释放因子hSos1结合Grb2并将受体酪氨酸激酶连接至Ras信号。 a> Nature 363（6424）：85-88
Zhang，L.，Du，L.，Shen，C.，Yang，Y.and Poovaiah，B.W。（2014）。通过泛素介导的调节Ca（2+） - 钙调蛋白-ATSR1/CAMTA3调节植物免疫植物J 78（2）：269-281。