材料和试剂

抗原蛋白
PVDF或硝化纤维素膜（Amersham biosciences/GE Healthcare Dharmacon）
Ponceau S（Sigma-Aldrich，目录号：P7170）
脱脂奶粉（康乃馨，任何您喜欢的品牌在本地商店）
吐温20（Sigma-Aldrich）
甘氨酸
乙酸
2 M Tris-HCl（pH 8.5）
NaCl
KCl
Na HPO ₄
KH ₂ PO ₄
超纯水
TBST（参见配方）
10x TBS（1升）（参见配方）
PBS（pH 7.4）（参见配方）
Ponceau S解决方案（参见配方）

设备

透析袋（Thermo Fisher Scientific/Pierce Antibodies，目录号：68035）
梳子

程序

将1-10mg纯化的抗原蛋白加载到合适的SDS-PAGE凝胶中注意1：高量的抗原蛋白对于以高纯度和产率回收抗体是必需的。尽可能加载尽可能多的蛋白质到凝胶中：
1. 使用宽梳（供应商通常有梳子，只有两口井：一个井是常规大小的标记，另一个井占用空间的其余部分）。
2. 不溶性蛋白质可以在变性条件下纯化
3. 即使对于可溶性蛋白质，可以通过用SDS上样缓冲液直接从纯化珠洗脱来实现更高的产量。
注意2：如果你的蛋白质有一个大的标签，如GST，MBP，NusA，你应该总是运行一个预防措施的抗这些标签的抗体从含有这些标签蛋白的印迹的血清。
转移到PVDF或硝化纤维素膜（注意，如果你的蛋白质尺寸小，选择0.2μm孔径而不是0.45μm）。
用Ponceau S溶液染色膜，切割含有您的抗原蛋白的条带尽可能小。
用100mM甘氨酸（pH 2.5）预洗脱膜10分钟。用TBST冲洗。
在室温（RT）下用TBST中的5％脱脂牛奶封闭1小时。
用TBST冲洗三次。
在4℃下孵育5-10ml抗血清过夜。取决于膜的大小。
用TBST洗三次。
通过将膜与1-2ml 100mM甘氨酸（pH 2.5）孵育2分钟来洗脱抗体。
孵育时，向试管中加入75μl-100μl2 M Tris-HCl（pH 8.5）。在步骤11之后，体积应允许最终浓度为150μMTris。
2分钟后，将1-2ml来自步骤9的1-2ml洗脱的抗体在甘氨酸中添加到来自步骤10的管中。Tris（pH8.5）应当中和酸性甘氨酸。
重复步骤9-11三次。
用PBS（pH7.4）透析级分并测定抗体浓度，作为您的常规蛋白质工作
测试与西方，免疫沉淀和免疫荧光的抗体。

食谱

10x TBS（1 L）
24.23克Tris
80.06克NaCl
在800 ml水中混合
用盐酸将pH调至7.6 将音量调节为1 L.
TBST（1 L）
100ml 10×TBS
900毫升超纯水
500μlTween 20
注意：吐温20非常粘稠，会粘在您的测量移液管的尖端。确保你拿到正确的数量，通过上下移动添加缓冲区。同时，缓冲液应搅拌。
PBS（pH7.4）（1L） 8克NaCl
0.2克KCl
1.44g的Na 2 HPO 4
0.24g的KH 2 PO 4 sub/
800ml H 2 O 2 / 将pH调节至7.4 用另外蒸馏的H 2 O调节体积至1L 高压灭菌
灭菌
Ponceau S溶液（1 L）
1 g Ponceau S
50ml乙酸
将H <2> O添加到1 L

致谢

该方案改编自Kurien（2009），并在美国加利福尼亚州斯坦福大学生物科学系Guowei Fang的实验室开发。 NIH的资助支持了这项工作。

参考文献

Kurien，B.T。（2009）。从硝化纤维素蛋白质印迹上切下的抗原条带中亲和纯化自身抗体 Methods Mol Biol 536：201-211。