材料和试剂

无病毒蝴蝶兰植物
TOP10大肠杆菌（大肠杆菌）感受态细胞
根癌农杆菌菌株EHA105
Gel/PCR DNA片段提取试剂盒（Geneaid Biotech，目录号：DF100）
（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：11789-020）。
选择性板（含50μg/ml卡那霉素的LB平板）
高速质粒迷你试剂盒（Geneaid Biotech，目录号：PD100）
Acetosyringone（Sigma-Aldrich，目录号：D134406）
Murashige和Skoog盐（Sigma-Aldrich，目录号：M5524）
胰蛋白胨（US Biological，目录号：12855）
酵母提取物（Affymetrix，目录号：23547）
NaCl（Sigma-Aldrich，目录号：S1446）
Tris-HCl（US Biological，目录号：22676）
CaCl 2（Inter-County Mechanical Corp.，目录号：03-11250）
甘油（J.T.Baker ，目录号：2136-01）
Luria Broth培养基（LB培养基）（参见配方）
蛋白酶K溶液（见配方）
Murishige和Skoog培养基（MS培养基）盐（参见配方）

设备

GeneAmp PCR系统9700（Life Technologies，Applied Biosystems ）
层流柜
BioChrom Libra S50紫外/可见分光光度计（Biochrom）
培养箱振动器
电穿孔机（Kaneka Corporation，Eurogentec）
电穿孔杯（EquiBio，目录号：ECU-102）
MiniSpin Eppendorf离心机和50 ml锥形离心管
带针头的1 ml注射器
水浴

程序

pCymMV- Gateway质粒DNA的构建
1. 用于沉默的靶基因的DNA片段，用于插入到pCymMV- Gateway中载体（图1A）通过PCR扩增获得在两者中含有29-nt attB重组位点的寡核苷酸引物（见注1）。通过使用凝胶提取纯化attB-PCR产物 kit。
2. 通过使用BP重组反应将目标基因片段插入pCymMV-Gateway载体（图1B）
  1. 在室温下在1.5ml微量离心管中混合B-PCR 产物（150ng），pCymMV-Gateway载体（150ng）和4μl5×BP Clonase TM sup/TM反应缓冲液。然后加入1×TE缓冲液（pH 8.0）直至总量获得16μl的体积
  2. 去除BP Clonase ^TM酶混合物从-80℃储存并放在冰上2分钟解冻和短暂涡旋两次（每次2秒）。
  3. 加入4μlBP Clonase TM sup /酶混合物（步骤A2a，上述）。通过涡旋混合两次，然后微量离心机。将BP Clonase ^TM酶混合物储存在-80℃ 立即使用。
  4. 在25℃下孵育反应60分钟
  5. 向每个样品中加入2μl蛋白酶K溶液以终止反应
  6. 短暂涡旋并在37℃孵育样品10分钟。
3. 转化能力。大肠杆菌与用于扩增的pCymMV-Gateway载体（在层流箱中）。
  1. 孵育TOP10 E。大肠杆菌感受态细胞在冰上10分钟（见注2）
  2. 加入5微升每个BP反应（步骤A2）到50-100微升TOP10 em。大肠杆菌感受态细胞
  3. 在冰上孵育15分钟。
  4. 通过在42℃水浴中孵育45秒来杀死Heatshock细胞。
  5. 在冰上孵育2分钟。
  6. 加入200微升LB培养基，并在37℃孵育60分钟，同时以200转/分钟摇动
  7. 将每次转化（305μl）铺在含有50μg/ml卡那霉素的LB-琼脂培养基平板上
  8. 在37℃孵育13小时。
4. 随机选择两个到四个菌落的每个构造，然后传代培养
5. 回收和纯化质粒
6. 使用基因特异性正向引物通过PCR确认每个构建体和 general reverse primer （CymMV 5351， 5'-CTTCTGTACCATACACATAG-3'）。
在重组的pCymMV- Gateway载体（层流箱中的步骤B1-3）扩增后通过电穿孔转化
1. 解冻根癌土壤杆菌（EHA105菌株）感受态细胞室温下立即置于冰上。转移100微升感受态细胞至冰上的冷冻电穿孔杯。加入1-2μl 的重组pCymMV- Gateway载体（可以使用150ng质粒DNA 取决于细胞的能力），轻轻混合并保持在冰上
2. 执行电穿孔。
  1. 将比色杯插入电穿孔室并启动电穿孔。电压和脉冲时间参数已预先设置。
  2. 立即在比色杯中加入200μlLB培养基，并将溶液转移到无菌的Eppendorf管中
  3. 在28℃下孵育混合物 30分钟。同时在200rpm下摇动。
3. 将所有混合物铺在含有100的选定LB-琼脂培养基平板上 μM的乙酰丁香酮和50μg/ml的卡那霉素，并在28℃下孵育保持16小时
4. 通过PCR用基因特异性确认每个菌落正向引物和一般 reverse 引物（CymMV 5351， 5'-CTTCTGTACCATACACATAG-3'）在网关向量上存在修改的结构
  （A）
  
  （B）
  
  图1。（A）的示意图 pCymMV- Gateway载体。绿色矩形表示开放阅读框由
对蝴蝶兰植物的农业渗透
1. 准备电穿孔感受态农杆菌细胞：
  1. 四天，将含有重组质粒的单个土壤杆菌属根瘤土壤杆菌转移到5ml LB培养基中含有100μM乙酰共溶素和50μg/ml卡那霉素，在28℃下培养16小时，同时以200rpm振荡。
  2. 亚文化细菌细胞在50ml含有100μM的LB培养基中 Acetosiringone和50μg/ml卡那霉素，并在28℃孵育13-16 同时以200rpm振摇直至OD 600达到0.8-1.0（约3-5小时）。
  3. 收获，转移培养到50毫升离心瓶和在4℃下离心10分钟3,000xg 。从这一步细胞应该在整个准备过程中保持冷
  4. 离心后，去除尽可能多的上清液。重悬细胞沉淀通过加入300μl含有100μM乙酰丁香酮的MS培养基。它是在室温下放置0.5小时而不摇动。
2. 浸润100微升土壤杆菌通过使用具有针的1ml注射器（参见注释3），在无病毒的蝴蝶兰植物中包含重组的pCymMV Gateway载体的根瘤土壤杆菌。
3. 使用两种方法之一进行渗透（图2和图3）：
  1. 对于叶片注射，将悬浮液注入叶片的背侧或层状区域，但不包括尖端，基部，中心和边缘部分叶子（通常是蝴蝶兰的第三最年轻的叶子）正好在花序上方出现（图2，左图和图（图3A）
  2. 对于花序注射，注射悬浮液花茎（图2，右图和图3B）八个节间和一个可见的花蕾（挤出它的 bract）。外me茎通常从茎之间出现在第三者之间和第四叶注射后，注射区域在表皮表面下变成深绿色，比未注射的区域（图3C-D）。
4. 植物注入后应该恢复稳定和规律在防虫和热控制（20-25℃）温室
5. 农杆菌浸润的花序绽放，第一朵花在农杆菌浸润后31-35天出现。
6. 通过PCR确认土壤杆菌渗入，病毒移动和转基因表达的沉默（参见注释4）。
  
  图农杆菌无病毒蝴蝶兰 >植物。A.用重组的pCambia-CymMV载体注入土壤杆菌进入具有农杆菌的叶（左图）或花秆（右图）使用1毫升注射器进行液体培养
  
  图3.演示在（A）叶的背轴侧和（B）花的进行渗透茎。（C和D）注射前后的叶子。注射可以区分观察到的区域（红色箭头）。

笔记

为了产生适合在使用pCymMV-Gateway载体的Gateway ^？ BP重组反应中用作底物的PCR产物，需要将attB位点并入PCR产物中：
1. 正向PCR引物必须含有attB1位点（5' GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3'）在3'末端，随后至少 18-25bp的模板或基因特异性序列
2. 反之 PCR引物必须包含attB2位点（5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3'）在3'末端，然后至少 18-25bp的模板或基因特异性序列
3. 记住基因特异性核苷酸需要与attB序列同框并应删除终止密码子。
4. 位置和长度的用于沉默的插入片段的扩增子是不同的这取决于个体基因并且需要针对每个靶标进行优化基因。例如，大（1,498bp）和小（81bp）大小的插入物片段PeUFGT3 显示显着的沉默效应（Hsieh et al。， 2013a）。要避免非特定定位，最好选择基因特异区域用于引物设计
5. 对于插入片段扩增，使用标准PCR反应条件，但是更好使用具有校对阅读能力的DNA聚合酶。较高的琼脂糖百分比提高了较小条带的分辨率以区分PCR 产物从引物通过琼脂糖凝胶电泳。洗脱DNA d.d.H sub 2 O或TE缓冲液中，通过使用凝胶提取纯化PCR产物试剂盒。
TOP10的转化效率。大肠杆菌感受态细胞应等于或超过1.0×10 9个菌落/ml。
用于浸润的农杆菌混合物的最佳量取决于蝴蝶兰植物的生长阶段，器官和品种。我们建议在每个成熟的蝴蝶兰植物中渗入100μl的农杆菌混合物，以确保它们的发育和生长不受影响。
使用从注射区域上方的叶或花组织提取的总RNA进行cDNA合成。用网关载体上的基因特异性正向引物和一般反向引物（CymMV 5351,5'-CTTCTGTACCATACACATAG-3'）进行RT-PCR。

食谱

Luria Broth培养基（LB培养基）
10 g/L胰蛋白酶
5g/L酵母提取物
10g/L NaCl（pH 7.0）
蛋白酶K溶液
2μg/μl在10mM Tris-HCl（pH7.5）中的蛋白酶K 20mM CaCl 2/
50％甘油
Murishige和Skoog介质（MS介质）盐
主要盐（大量营养素）：
1,650mg/L硝酸铵（NH 4 NO 3）
440mg/L氯化钙（CaCl 2）2/2H 2 O 2）。 370mg/L硫酸镁（MgSO 4）7H/7H 2 O）
170mg/L磷酸钾（KH 2 PO 4）
1,900mg/L硝酸钾（KNO 3）次要盐（微量营养素）
6.2mg/L硼酸（H 3 BO 3）
0.025mg/L氯化钴（CoCl 2）6/6H 2 O）。 0.025mg/L硫酸铜（CuSO 4钠）5 H 2 O 2）。 27.8mg/L硫酸亚铁（FeSO 4）7H/7H 2 O）
22.3mg/L硫酸锰（MnSO 4·4H 2 O·4H 2 O）。 0.83mg/L碘化钾（KI）
0.25mg/L的钼酸钠（Na 2 MoO 4+）。 2H 2 O 8.6mg/L硫酸锌（ZnSO 4，7H 2 O，7H 2 O）。 37.2mg/L Na 2 EDTA缓冲液。 2H 2 pH 5.8

致谢

作者要感谢Lu博士（台湾南部生物技术中心）在病毒载体构建中的帮助。

参考文献

Hsieh，M. H.，Lu，H. C.，Pan，Z.J.，Yeh，H. H.，Wang，S. S.，Chen，W. H. and Chen，H. H.（2013a）。使用花旗病毒在中优化病毒诱导的基因沉默效率 >蝴蝶兰花。植物科学 201-202：25-41。
Hsieh，M. H.，Pan，Z.J.，Lai，P. H.，Lu，H. C.，Yeh，H. H.，Hsu，C. C.，Wu，W. L.，Chung，M. C.，Wang，S. S.，Chen，W. H. and Chen，H. H.（2013b）。病毒诱导的基因沉默解开了涉及蝴蝶兰花卉生长和发育的多种转录因子/em> orchids。 J Exp Bot 64（12）：3869-3884。
Lu，H.C.，Chen，H.H.，Tsai，W.C.，Chen，W.H.，Su，H.J.，Chang，D.C.and Yeh，H.H。（2007）。涉及兰花繁殖阶段的基因的功能验证策略植物Physiol 143（2）：558-569。
Lu，H.C.，Hsieh，M.H.，Chen，C.E.，Chen，H.H.，Wang，H.I。和Yeh，H.H。（2012）。用于筛选病毒诱导的植物防御中的转录因子的高通量病毒诱导的基因沉默载体在兰花中的反应。 Mol Plant Microbe Interact 25（6）：738-746。