材料和试剂

人参种子，其中合子胚处于成熟状态（长度为4mm）
根癌农杆菌 C58C1（pMP90）菌株
二进制（pCAMBIA1390）向量
MS粉末（Duchefa Biochemie，目录号：M0222）
蔗糖（Duchefa Biochemie，目录号：S0809）
2-（N-吗啉代）乙磺酸（MES）一水合物（MB电池，目录号：MB-M4837）
Phytoagar（Duchefa Biochemie，目录号：P1003）或Gelrite（Duchefa Biochemie，目录号：G1101）
酵母提取物（Duchefa Biochemie，目录号：Y1333）
蛋白胨（Duchefa Biochemie，目录号：P1328）
NaCl（Affymetrix，目录号：4171746）
Bactoagar（BD，目录号：214010）
潮霉素（Duchefa Biochemie，目录号：H0192）
卡那霉素（Duchefa Biochemie，目录号：K0126）
头孢噻肟（Duchefa Biochemie，目录号：C0111）
6-苄氨基嘌呤（BAP）（Duchefa Biochemie，目录号：B0904）
2,4-二氯苯氧基乙酸（2,4-D）（Duchefa Biochemie，目录号：D0911）
吲哚-3-丁酸（IBA）（Duchefa Biochemie，目录号：I0902）
蔗糖
植物琼脂
70％乙醇（EtOH）
2％（v/v）次氯酸钠（NaOCl）（Sigma-Aldrich，目录号：425044-1L）
B5培养基（Duchefa Biochemie，目录号：G0209）
MS（Murashige& Skoog）培养基（参见Recipes）
YEP介质（参见配方）
抗生素储备溶液（在ddH 2 O中）（参见配方）
植物生长调节剂储备溶液（见配方）

设备

层流柜（HEPA过滤器，粒径0.3μ和垂直型99.99％效率）
摇匀培养箱（在旋转振荡器上100〜200rpm）
离心机（3000×g）（Labnet International，目录号：C2500-R-230V）
微量移液器
镊子（Phoenix Technologies，目录号：ESD-16）
锥形烧瓶（50/100ml）或可高压灭菌的塑料管用于种子灭菌
高压釜机
生长室（23℃±2℃）
无菌滤纸
培养皿

程序

将种子在加湿砂中在15℃下分层4个月（图1）（参见图1），其中所述的人参（E参）），因为收获后即刻的合子胚处于未成熟的球状阶段（长度约200μm）。

图1.人参种子分层图。人参种子如图所示在方形水泥垫或木制方形盒内堆叠。将种子与河沙1：3（种子：沙）混合，或经常夹在具有沙子的网袋中上下，并通过每天浇水一次或两次保持在15〜20℃，10〜15％水分。 2毫米以内的砂是好的，粗砂在4毫米以内
然后将种子在2-4℃下进一步分层100天以破坏种子休眠。分层约6.5-7个月后，合子胚达到成熟阶段（图2C-D，长度约4.0-4.5mm），这意味着种子准备发芽。
一旦用手指暴露硬种子包衣，将种子浸入70％（v/v）EtOH中1分钟，在2％（v/v）NaOCl中表面灭菌15分钟，并用无菌蒸馏水图2A-B）在清洁台（图2A）中。使用手指和镊子小心地切割来自种子的合子胚，置于垂直含有3％（w/v）蔗糖和0.8％（w/v）植物琼脂的MS（Murashige和Skoog，1962）基础培养基上， -10天（图3A）。
将含有目的基因的植物二元载体（pCAMBIA1390）的根癌土壤杆菌C58C1（pMP90）（Bechtold和Pelletier，1998）菌株在5ml YEP液体培养基中培养过夜（170rpm，20小时）在28℃。第二天早上，5ml的A。根癌土细胞在100ml锥形瓶中传代培养直至OD 600nm达到0.6。用含有3％（w/v）蔗糖的液体MS培养基洗涤细菌细胞两次，并重悬于用于人参外植体感染的相同培养基中。
将子叶外植体（图2E和3A，4mm）用于根瘤土壤杆菌转化。 pCAMBIA1390载体在花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子下包含 hptII 和 nptII 基因（Lee等人，/em>，2010; Kim ，2014）。

图2.用于转化和灭菌的即食型人参种子。 A. Clean Bench。 B.人参种子灭菌。 C.有和没有硬种子外壳的人参种子，然后用胚乳覆盖的人参胚。 D.人参胚。 E.人参子叶准备用于土壤杆菌共培养
将外植体浸在细菌溶液中15分钟，随后用无菌滤纸吸干，并在含有3％（w/v）蔗糖和1μg/ml 2,4-二氯苯氧基乙酸（2,4）的MS培养基-D）2天（图3B）。
然后，将外植体在含有3％（w/v）蔗糖，1μg/ml 2,4-D，0.5μg/ml 6-苄基氨基嘌呤（BAP），250μg/ml 6-苄基氨基嘌呤（BAP）的MS选择培养基（称为愈伤组织诱导培养基） ml头孢噻肟和50μg/ml潮霉素（图3C）。在选择培养基上每两周传代培养三至四次后，将产生愈伤组织的存活子叶在不含抗生素的相同培养基上培养（图3D），并在含有3％（w/v）蔗糖的B5培养基上从愈伤组织诱导不定根和3mg/L吲哚-3-丁酸（IBA）（图3E）。
在含有3％蔗糖和2mg/L IBA的液体B5培养基中继代培养之前，从母体外植体切除不定根，每5周更换一次（图3F）。

图3.通过根癌土壤杆菌进行的人参转化用于转基因不定根诱导。 A.五天进一步生长子叶。 B.子叶外植体浸在细菌溶液中15分钟，随后用无菌滤纸吸干，并在含有3％（w/v）蔗糖和1μg/ml 2,4-二氯苯氧基乙酸（2， 4-D）2天。 C.在MS选择培养基，含有3％（w/v）蔗糖的1μg/ml 2,4-D，0.5μg/ml BAP，250μg/ml头孢噻肟和50μg/ml潮霉素的转基因愈伤组织选择。 D.在没有抗生素的相同培养基上培养存活的愈伤组织。 E.不定根在含有3％（w/v）蔗糖和3mg/L IBA的B5培养基上。 F.在含有3％蔗糖和2mg/L IBA的液体B5培养基中的继代培养

食谱

MS（Murashige& Skoog）培养基
得到2.2g的MS粉末
30克蔗糖 0.5克2-（N-吗啉代）乙磺酸（MES）一水合物 8g植物琼脂或0.25％Gelrite
用1N KOH将pH调节至5.6 121℃高压灭菌15分钟
YEP介质
10g酵母提取物 10g蛋白胨
5g NaCl和15g Bactoagar
用1N HCl调节pH至7.0 添加到dH 2 O到1,000ml
121℃高压灭菌15分钟
抗生素储备溶液（在ddH 2 O中）
潮霉素50mg/ml
卡那霉素50mg/ml
头孢噻肟200mg/ml
过滤灭菌（0.2μm）
植物生长调节剂储备液
1. 6-苄氨基嘌呤（BAP）：0.5mg/ml在1N NaOH中将50mg BAP溶解在少量1N NaOH中用ddH 2 O 2将体积调至100ml 高压灭菌或过滤灭菌（0.2μm）
  在-20°C下冻结
2. 2,4-二氯苯氧基乙酸（2,4-D）：在1N NaOH中1mg/ml 将100mg的2,4-D溶于少量1N NaOH中用ddH 2 O 2将体积调至100ml 高压灭菌或过滤灭菌（0.2μm）
  在-20°C下冻结
3. 吲哚-3-丁酸（IBA）：在1N NaOH中10mg/ml 将1g IBA溶解在少量1N NaOH中用ddH 2 O 2将体积调至100ml 高压灭菌或过滤灭菌（0.2μm）
  在-20°C下冷冻

致谢

这项工作得到了下一代生物绿色21计划（SSAC，拨款＃：PJ00952902），大韩民国农村发展局给ORL的资助。

参考文献

Bechtold，N。和Pelletier，G。（1998）。农杆菌介导的转化成虫拟南芥植物通过真空浸润。 Methods Mol Biol 82：259-266。
Kim，Y.J.，Lee，O.R.，Oh，J.Y.，Jang，M.G.and Yang，D.C。（2014）。 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a编码三萜皂草苷生产人参中基因的还原酶功能分析。 Plant Physiol 165（1）：373-387。
Lee，O.R.，Kim，S.J.，Kim，H.J.，Hong，J.K.，Ryu，S.B.，Lee，S.H.，Ganguly，A.and Cho，H.T.（2010）。磷脂酶A（2）是PIN- FORMED蛋白质运输到拟南芥根中的质膜。植物细胞22（6）：1812-1825。
Lee，O.R.，Sathiyaraj，G.，Kim，Y.J.，In，J.G.，Kwon，W.S.，Kim，J.H。和Yang，D.C。由人参中的病原体和非生物胁迫诱导的防御基因CA Meyer。 J Gins Res 35（1）：1-11。
Murashige，T。和Skoog，F。（1962）。用于快速增长的修订媒介用烟草组织培养物进行生物测定。生理药理学 15（3）：473-497。