材料和试剂

Sphero蛋白A聚苯乙烯颗粒（6-8μm）（Spherotech，目录号：PAP-60-5）
人抗p24抗Gag HIV-1 IIIB多克隆抗体（ImmunoDX，目录号2503）
正常人IgG（Sigma-Aldrich，目录号：I2511）
p24 Gag 重组蛋白（Abcam，目录号：ab43037）
与荧光素异硫氰酸酯（FITC）或也称为RD1（Beckman Coulter，目录号：6604665和6604667）缀合的抗p24 Gag KC57克隆
1×磷酸盐缓冲盐水（PBS），不含钙和镁（Corning，目录号：21-031-CV）
牛血清白蛋白（BSA）（Axenia Biologix，目录号：S200）
Triton X-100（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP151-500）
16％多聚甲醛（PFA）溶液（Electron Microscopy Sciences，目录号：15710）
荧光激活细胞分选（FACS）染色缓冲液（参见配方）

设备

Eppendorf离心机
旋转搅拌器
96孔V型底板（可选）（Thermo Fisher Scientific，目录号：12-565-216）
用于96孔微量培养板（Thermo Fisher Scientific，目录号：14-245-53A）的Thermo Fisher盖子
板密封剂（VWR International，目录号：62402-921）
Eppendorf管
多通道移液器（可选）
Pipetman
提示（1 ml，200μl和10μl）
试剂库（可选）
用于Eppendorf管或96孔板（可选）的组织培养离心机
37℃孵育器
流式细胞仪
注意：FLAQ需要配备蓝色激光激发（488 nm）和一个测量参数的流式细胞仪。具有525/50 nm或585/42带通滤波器的光电倍增管（PMT）分别用于检测FITC或RD1（藻红蛋白）信号。

软件

Forecyt（Intellicyt）
FlowJoX软件（Tree Star）或其他FACS分析软件

程序

制备用p24 Gag HIV-1 IIIB多克隆抗体包被的FLAQ珠子
1. 吸取1 ml Sphero蛋白A聚苯乙烯颗粒（以下称为珠）到离心管中。
2. 在12,000rpm离心2分钟以沉淀珠粒。
3. 除去上清液。
4. 加入1毫升1×PBS的珠粒，离心12,000 rpm，2分钟
5. 用80μl的商业小瓶重悬珠粒人类抗p24 ^Gag HIV-1 IIIB多克隆抗体浓度1mg/ml。吸移三次上下，孵育15 min，在室温下在旋转混合器上
6. 在12,000rpm离心2分钟以沉淀珠粒。
7. 取出并保留含抗体的上清液。
8. 加入1毫升1×PBS的珠粒。
9. 在12,000rpm离心2分钟。
10. 再加1ml 1×PBS。
11. 在12,000rpm离心2分钟。
12. 添加到珠粒100μl含有4.8的1x PBS溶液 mg/ml人正常IgG封闭试剂。通过吹吸和向上充分混合下降3次。
13. 在室温下在旋转混合器上孵育15分钟
14. 在12,000rpm离心2分钟以沉淀珠粒。
15. 弃去上清液。
16. 用1ml 10mg/ml BSA的PBS洗涤珠两次，每次以12,000rpm旋转2分钟。
17. 将珠子重悬在1ml的10mg/ml BSA的PBS中，并将这些"FLAQ珠子"保存在4℃。
18. 使用含有步骤7（注1）的p24 ^Gag HIV-1 IIIB多克隆抗体的上清液重复步骤A1-17。
测量病毒制剂中的p24 ^Gag含量
1. 以8μg/ml重悬在FACS缓冲液中的Abcam p24Gag蛋白。等分和冻结。
2. 通过连续制备200μl的Abcam p24 ^Gag蛋白标准品在具有0.5％Triton-X100的FACS缓冲液中稀释1/2。通常我们执行8 系列稀释度范围为10ng/ml至78.12pg/ml。
3. 收成并在补充的FACS缓冲液中制备稀释液用0.5％Triton-X100（注2）。每个样品需要160μl。
4. 准备每个样品包含以下物质的混合物：
  0.5μl与RD1或FITC结合的KC57 0.5μlFLAQ珠子
  39μlFACS缓冲液0.5％Triton X-100
5. 转移160微升标准品和病毒上清液到96孔V型底板
6. 向每个孔中加入40μl试剂混合物并混合
7. 在37℃孵育1小时
8. 将每个板在2,000rpm离心2分钟。不要使用板密封剂在此步骤中避免由于低的良好对污染补充有0.5％Triton的FACS缓冲液的表面张力 X-100。
9. 弃去上清液，并用150μlFACS缓冲液洗涤珠子一次
10. 将每个孔中的珠子重悬在100μl含有1％PFA的FACS缓冲液中
11. 在流式细胞仪上采集样品，这将创建文件 FCS扩展。 FCS文件是包含流式细胞仪标准文件所有的规格需要完全描述实验数据流集。
12. 分析fcs文件以获取中值通过FITC或PE检测器的珠的荧光强度用分别与FITC或RD1缀合的KC-57进行的实验。
13. 绘制PE通道（x轴）中的荧光中位数 Excel中标准（y轴）中p24 的浓度。添加后趋势线，确定适合标准曲线的方程最好并计算未知物的浓度（y值）。

代表数据

图1.代表性数据 A. FLAQ测定的原理。 B.门控策略。珠子群首先在前向散射区（FSC-A）和侧向散射区（SSC-A）上门控。珠粒群体对于标准品（10ng/ml至78.12pg/ml）的覆盖。 C.标准曲线。

笔记

我们可以重复使用抗体至少5次，产生5毫升珠。每次重复使用时，中值荧光略低。
triton的存在确保了病毒制剂的良好稀释。来自转染的293T的上清液应含有500至1,000ng/ml的p24 Gag蛋白，而来自受感染培养物（SupT1或PBMC）的上清液的范围为20至200ng/ml。通常分析每个样品的三个稀释度以确保测量将落入测定的动态范围内

食谱

荧光激活细胞分选（FACS）染色缓冲液
1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）
2％胎牛血清储存在4°C

致谢

我们要感谢Hayden等人开发FLAQ测定法。

参考文献

Hayden，M.S.，Palacios，E.H。和Grant，R.M。（2003）。使用荧光染料实时定量HIV-1 p24和SIV p27， linked antigen quantification assays。 AIDS 17（4）：629-631。