材料和试剂

浮萍叶，（从中国太湖地区的稻田排水渠收集）
无菌去离子水
甲醇（HPLC级）（Sigma-Aldrich，目录号：179337）
盐酸（HCl）（Sigma-Aldrich，目录号：653799）
甲醛溶液（37重量％的H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：252549）
次氯酸钠（NaClO）（有效氯4.00-4.99％）（Sigma-Aldrich，目录号：239305）
0.15％甲醛溶液（见配方）
0.5％v/v NaClO（参见配方）
改良的Steinberg营养液（见配方）

设备

浮萍根分泌物收集装置（图1）
1. 有机玻璃罐（D×H，16×16cm）
2. 玻璃柱（D×H，23×170mm）
3. XAD-4树脂（20-60目）（Sigma-Aldrich，目录号：37380-42-0）
4. 疏水性氟孔（PTFE）膜（14×14cm）
5. 玻璃棉（Sigma-Aldrich，目录号：18421）
6. 特氟龙塞子
7. 铝箔
8. 硅胶管
  
  图1.在根系分泌物收集中使用的设备
清洁长椅
蠕动泵
旋转蒸发器（Tokyo Rikakikai，EYELA，型号：N-1100D）
冷冻干燥机（Freezone Plus 2.5）（Labconco）
孵育室（23±1℃，荧光灯下100μmol/m/s，16小时光照/8小时黑暗）

程序

无菌浮萍叶片的制备
1. 用去离子水洗涤100棵浮萍叶片5分钟。转移叶片置于具有200ml的0.5％v/v NaClO的500-ml烧瓶中并轻轻搅拌 30分钟。
2. 冲洗表面消毒的植物五次无菌去离子水。将其转移到具有200ml的500ml烧瓶中无菌改良Steinberg营养液注意：这应该在一个干净的工作台上进行。
3. 叶片在23±1℃的孵育室中静止生长在荧光灯下以100μmol/m 2/s/s（16小时光照/8小时黑暗）直至使用（图2）。
  
  图2.浮萍叶状体的孵育条件
  
  注意：浮萍叶片会在几小时后逐渐失去叶绿素灭菌（6小时后）。一天后，生长点是保护胶囊保持绿色，而其他部分叶片变成完全黄色。三天后，新的叶状体生长从增长点，但更小。他们将完全恢复五天。因此，浮萍将需要大约十天的时间通常在灭菌后（图3）。
  
  图3.浮萍灭菌后每个阶段的叶状体。 A。灭菌前。乙。 6小时后。 C. 1天后。 D.3天后。 E.5天后。 F.10之后天。
无菌根分泌物收集装置的制备
1. 将有机玻璃罐，玻璃柱和硅胶管浸泡在0.15％福尔马林溶液过夜。用无菌去离子水洗涤它们
2. 将玻璃棉浸泡在2M HCl中过夜，用无菌洗涤去离子水3次，至pH 7.0，然后高压灭菌。
3. 洗 XAD-4树脂用无菌去离子水。用树脂洗脱树脂甲醇。将清洁的树脂储存在黑色玻璃容器中的甲醇中直到使用。
4. 玻璃柱固定在铁支架上。放在底部约0.2g玻璃棉，以防止树脂泄漏与玻璃棒（图4A）。将5厘米长的硅胶管连接到玻璃柱底部（图4B）。
5. 搅拌XAD-4树脂和包装该柱用60ml浸泡的树脂（图4C-D）。删除残留物甲醇通过用约1.5L无菌去离子洗涤柱水。
  注意：保持列垂直，以避免偏差流。缓慢倒入树脂，避免气泡。
6. 用夹子固定管子，以避免树脂柱变干（图4E）。
7. 保持水和树脂水平切线（图4F）。放0.2克的玻璃纤维顶部的树脂隔离空气和固定树脂（图4G）。
8. 将色谱柱连接到锅的顶部通过穿孔的特氟隆塞。用铝箔包裹柱子以限制光和阻止藻类生长（图4H）
9. 用硅管将蠕动泵连接到锅底。
  
  图4.准备和包装色谱柱。 A，B.放一些玻璃棉在底部并与硅胶管连接。 C，D搅拌XAD-4 树脂并包装柱。 E.用夹子固定管子。 F，G. Keep 水和树脂水平切线，并在上面放一些玻璃棉。 H。包装用铝箔。
收集浮萍根渗出物
1. 洗涤100cm 2（约2g鲜重，50％覆盖）的无菌浮萍叶片两次用无菌水。移植他们到锅里含2 L无菌营养液。用一个盖子锅高压灭菌疏水性荧光（PTFE）膜保持无菌环境注意：这应该在一个干净的工作台上进行。
2. 开始化学捕集。营养液以一定速率循环为10毫升/分钟的蠕动泵。渗出物是连续的附着在树脂上
3. 五天后，用1.5L去离子水分离柱子。用150ml甲醇洗脱。
4. 在40℃下真空蒸发甲醇。冷冻干燥剩余水溶液，将残余物重新溶解在1ml甲醇中，储存于-20°C。
  
  图5.连续浮萍根渗出物捕获系统（Lu et al。，，2014）。收集系统。 B.收集系统图。营养溶液连续循环通过根系浮萍植物，洗脱浮萍衍生的有机化合物。疏水性或部分疏水性渗出物被选择性吸收通过XAD-4树脂，而无机营养物被回收维持浮萍生长。

食谱

0.15％甲醛溶液
混合20ml甲醛溶液在5L去离子水中
0.5％v/v NaClO/v 将1ml NaClO溶于199ml去离子水中
储存在4°C
改良的Steinberg营养液
0.42mM Ca（NO 3）2 Sub 2 O 4/4H 2 O 2 / 0.23mM NH 4 Cl/s 0.41mM MgSO 4。7H 2 O 2 12.9μMKH sub 2 PO 4 sub
0.63μMZnSO 4 sub 7H O
0.91μMMnCl 2 4H 2 O 1.94μMH sub 3 BO ₃
0.18μMNaMoO 4 ^。 2H O 2.80μMFeCl 3 3 ^。 6H 2 O O 2.80μMNa 2 EDTA EDTA。 2H 2 O 用1M NaOH调节至pH 6.8 高压灭菌器
在室温下贮存

致谢

这项工作得到了中国科学院"土壤微生物系统功能与调节"（XDB15030100）和国家科学技术计划（2012BAD15B03）战略重点研究计划（B）的资助。这个协议发表在我们的自然论文（Lu 等人，2014）。

参考

Kong，C.，Liang，W.，Xu，X.，Hu，F.，Wang，P.and Jiang，Y。从化感水稻幼苗释放和活性化合物。 Agric Food Chem 52（10）：2861-2865。
Lu，Y.，Zhou，Y.，Nakai，S.，Hosomi，M.，Zhang，H.，Kronzucker，H.J。和Shi，W。根系分泌物成分刺激水生浮萍根际氮的除氮。 Planta 239（3）：591-603。
Tang，C.S。和Young，C.C。（1982）。从Bigalta Limpograss的不受干扰的根系统收集和鉴定对映异构化合物（ Hemarthria altissima 69 69（1）：155-160。