材料和试剂

PC-3细胞（ATCC，CRL-1435，目录号：7348669）
化合物的三倍系列稀释物
MitoTox ^TM MitoBiogenesis ^TM In-Cell ELISA Kit（Abcam，目录号：ab110216），包括
1. 1,000x IRDye ^？标记的二抗（物种未被供应商披露）
2. 200x一抗（物种未被供应商披露）
3. 100x Triton X-100
4. 10x阻塞缓冲区
5. 10x磷酸盐缓冲盐水（PBS）
6. 400x Tween-20
7. 1x Janus绿色染色剂（可选）
DMSO（细胞培养级）（Sigma-Aldrich，目录号：D2650）
CellTiter Glo（Promega Corporation，目录号：G7571）
Kaighn's F12（Life Technologies，Gibco ，目录号：21127）
FBS（HyClone，目录号：SH30071.03）
100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素（P/S）（Life Technologies，Gibco ，目录号：15140-122）
细胞固定试剂：4％多聚甲醛（20％多聚甲醛，VWR International，目录号：15713-S）
氯霉素（10mM的DMSO溶液）（Sigma-Aldrich，目录号：C1919-5G）
Kaighn's F12培养基（见配方）
注意：将细胞维持在Kaighn's F12培养基中。细胞每周传代两次并维持在90％汇合。第4和第15代之间的细胞用于测定。

设备

96孔板（胶原I包被的96孔板）（VWR International，目录号：73521-028）
滴定板振荡器（Lab-line仪器，型号：4626）
LI-COR ^® Odyssey仪器（LI-COR）

软件

GraphPad Prism 5.0（GraphPad软件）

程序

将PC-3细胞以2.5×10 3个细胞/孔的密度接种在处理前一天的胶原包被的96孔板中的每孔100μl的最终测定体积中。 />
在治疗当天，在接近化合物的一般细胞毒性5天CC 50值的浓度开始，在96孔板中一式两份制备化合物在DMSO中的三倍系列稀释液。通过监测细胞ATP水平的变化来测量CC 50值。对于具有一般细胞毒性CC 50值≥100μM的化合物，起始浓度为100μM。代表性的96孔板图如图1所示。
1. 用0.5％DMSO处理图1中标记为空白的外孔，并用作将来数据分析的背景。
2. 将0.5％DMSO处理的细胞（图1中标记为DMSO对照）用作非药物处理的对照。
将化合物与培养基混合以制备2×化合物 - 培养基溶液，然后向96孔细胞板中的相关孔中加入100μl/孔的2×化合物 - 培养基溶液。孔的最终体积为200μl。最终的DMSO含量为0.5％
孵育5天后，将细胞用50μl/孔的4％多聚甲醛在室温下固定20分钟。固定后，用1×PBS洗涤细胞两次（由稀释10×PBS制备）
1. 此时，可以将板用100μl/孔的1×PBS在4℃下储存至多一周。
使用定量免疫细胞化学来测量培养细胞中复合物II（SDH-A）和IV（COX-1）的蛋白水平的MitoBiogenesis TM sup/In-Cell ELISA试剂盒分析细胞，以下步骤：
1. 用100μl/孔的1x透化处理使细胞透化缓冲液（用1×PBS稀释100×Triton X-100制备）30分钟 min，在室温下在轻度摇动下在滴定板振荡器上恒定速度（在Lab-line仪器上设置2）。速度相同当使用振动器时，在所有以下步骤中使用设置
2. 从细胞板除去透化缓冲液后，细胞与2x封闭缓冲液（200μl/孔）在37℃温育2小时室温，在滴定板振荡器上轻轻搅拌
  1. 2×封闭缓冲液由1×PBS的10×封闭缓冲液的稀释制备。
3. 除去封闭缓冲液后，将细胞与1x孵育一抗在1x封闭缓冲液（100μl/孔）中4℃过夜 ℃，在滴定板振荡器上轻轻搅拌
  1. 1x封闭缓冲液通过用1x PBS稀释10x封闭缓冲液制备
  2. 1x一抗是用1x封闭缓冲液稀释200x一抗制备的。
  3. 用不含抗体的1x封闭缓冲液处理外孔。
4. 第二天，用1×PBS-Tween缓冲液（300μl/孔，3次）洗涤细胞三次。
  1. 从用1x PBS稀释400x吐温-20制备1×PBS-Tween缓冲液。
5. 洗涤后，将细胞与1×标记的IRDye温育二抗在1x封闭缓冲液（100μl/孔）中室温2小时在滴定板振荡器上轻轻搅拌温度
  1. 1x封闭缓冲液通过用1x PBS稀释10x封闭缓冲液制备
  2. 从稀释制备1×标记的次级抗体的1000倍IRDye ^{标记的二抗与1x封闭缓冲液}
  3. 用不含抗体的1x封闭缓冲液处理外孔。
6. 用1×PBS-Tween缓冲液（300μl/孔）洗涤细胞5 并保持在1×PBS-Tween缓冲液（200μl/孔）中直到成像
  1. 从用1x PBS稀释400x吐温-20制备1×PBS-Tween缓冲液。
7. 使用LI-COR Odyssey进行IR成像和定量仪器使用700（SDH-A）和800（COX-1）根据制造商的说明（图2）。导出数据进行分析。
使用GraphPad Prism软件分析数据：
1. 通过减去平均值获得背景校正的结果背景值，其使用所有外井计算不含如前所述的化合物处理或抗体步骤。
2. 将0.5％DMSO处理的细胞用作100％（未处理的）对照
3. 单个蛋白质水平表示为0.5％DMSO对照的百分比。
4. 在细胞活力受到严重影响的情况下，线粒体生物发生被排除在分析之外与低信号相关的显着误差。
5. 氯霉素用作测定的阳性对照，代表性的剂量 - 反应如图3所示
  
  图1.代表性96孔板图
  
  图2.一个代表性的96孔板红外图像。照片摘自2012年1月的MitoSciences网站。
  
  图3.氯霉素对线粒体生物发生的抑制 5天培养后的PC-3细胞。 COX-1和SDH-A的％水平分别显示在（•）和（▼）中。细胞活力，如（■）所示，使用另一个96孔PC-3细胞板并行监测使用CellTiter Glo。绘制的数据为平均值±标准误差来自重复测量。 CC 50值为2.4,13.4和88μM 分别为COX-1，ATP和SDH-A水平。

笔记

将Mitobiogenesis CC 50值定义为与DMSO对照相比，个体蛋白水平（COX-1或SDH-A）降低50％的浓度。使用GraphPad Prism 5.0分析数据。通过使用S形剂量 - 反应（可变斜率）方程[四参数对数方程]的非线性回归分析计算CC 50值：Y =底部+（顶部 - 底部）/（1 + 10 其中Bottom和Top值分别固定为0和100，计算有丝分裂生成CC 50值作为（对数的）平均2〜3次独立实验。

食谱

凯恩的F12培养基
Kaighn的F12
10％FBS
100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素（P/S）

致谢

所有的工作是由吉利德科学公司赞助的。该协议改编自Feng等人（2014）。

参考文献

Feng，JY，Cheng，G.，Perry，J.，Barauskas，O.，Xu，Y.，Fenaux，M.，Eng，S.，Tirunagari，N.，Peng，B.，Yu，M.，Tian Y.，Lee，YJ，Stepan，G.，Lagpacan，LL，Jin，D.，Hung，M.，Ku，KS，Han，B.，Kitrinos，K.，Perron，M.，Birkus，，Wong，KA，Zhong，W.，Kim，CU，Carey，A.，Cho，A.and Ray，AS（2014）。通过GS-6620（一种有效的C-核苷单磷酸酯前药）抑制丙型肝炎病毒复制。 a> Antimicrob Agents Chemother 58（4）：1930-1942。
MitoTox TM MitoBiogenesis TM细胞内ELISA试剂盒（IR）（Abcam，目录号：ab110216）的说明书。 http：//www.abcam .com/mitobiogenesis ^TM -in-cell-elisa-kit-ir-ab110216.html。