图1. camalexin的结构式

材料和试剂

拟南芥叶子
液氮
二氯甲烷（DCM）（Sigma-Aldrich，目录号：270997）
甲醇（LC/MS级）（Carlo Erba Reagents，目录号：414831）
甲酸（梯度级）（Sigma-Aldrich，目录号：F0507）
含有0.1％甲酸的水（LC/MS级）（Sigma-Aldrich，目录号：34673）
Camalexin标准（Sigma-Aldrich，目录号：SML1016）
提取缓冲液（参见配方）

设备

砂浆和杵
小铲
玻璃巴斯德移液器
管适配器
螺旋盖圆底硼硅酸盐玻璃培养管（16×125mm）（Pyrex）（Sigma-Aldrich，目录号：Z653594-40EA）
一次性硼硅酸盐玻璃培养管（Pyrex）
具有尼龙膜的Spin-X离心管过滤器（Sigma-Aldrich，目录号：CLS8170-200EA）
带盖的玻璃小瓶（容量：100μl）
涡流搅拌器
摇床
氮气蒸发器（例如具有干燥块DB-3D的样品浓缩器）（Techne）（图1）
余额
变速冷冻离心机，转子数量转子腔×标称最大负载（容量：8×50ml）（例如，Beckman Coulter）
HPLC（例如Thermo Fisher Scientific，型号：UltiMate 3000HPLC）
高效反相色谱柱C18用于分离小分子（例如Acclaim 120C8反相柱-3μm，200，2.1x 150mm）（Thermo Fisher Scientific，目录号：059130）
ESI-质谱仪（例如 Orbitrap XL Discovery，Thermo Fisher Scientific）

软件

分析软件（例如Thermo Xcalibur软件2.10，Thermo Fisher Scientific）

程序

植物材料的制备
注意：
1. 需要至少50-100mg的4周龄拟南芥植物叶。
2. 在冷冻于液氮中之前应称重拟南芥叶。
3. 应分析每个样品至少4个生物学重复。
1. 准备并预冷提取缓冲液。
2. 预冷离心机转子在4°C
3. 冷冻称重的拟南芥叶在液氮中
4. 使用研钵和杵将叶组织粉碎成粉末
5. 使用刮刀将每个样品转移到圆底螺旋盖的硼硅酸盐玻璃管（Pyrex）中。
6. 将样品保存在冰上。
卡马西林提取
1. 在每个管中加入提取缓冲液，保持比例1:10 [组织（mg）：提取缓冲液（μl）]。
2. 涡旋样品20秒。
3. 在振荡器上摇动管（30分钟，100rpm，4℃）
4. 在保持比例1:2 [提取缓冲液（μl）：DCM（μl）]的每个样品中加入DCM。
5. 在振荡器上摇动管（30分钟，100rpm，4℃）
6. 离心（10分钟，5,000x g，4℃）。
  注意：离心后将形成两相。含有Camalexin 在下部绿色相中，而上部相主要含有DCM。植物碎屑将存在于两层之间。
7. 收集下相通过使用玻璃巴斯德吸管并将其转移一次性硼硅酸盐玻璃培养管（Pyrex）注意：应特别注意不要恢复在两个阶段之间的界面中浮动的任何材料。
8. 在氮气流（10巴）下浓缩收集的下层相并在42℃下加热管
9. 使样品完全干燥，然后将其悬浮在甲醇中，比例为1：1 [组织（mg）：甲醇（μl）]。
10. 通过使用spin-X离心管（5分钟，10,000×g，4℃）过滤样品。
11. 将过滤的样品转移到玻璃瓶小瓶中。
Camalexin检测和定量
HPLC与MS偶联
1. 在配有的Ultimate3000 HPLC系统中，每个样品注入20μl Acclaim 120 C18反相柱。流动相由含有0.1％甲酸的水（LC/MS级），作为溶剂A和甲醇用0.1％甲酸（LC/MS级）作为溶剂B.设置：
  流速：0.2ml/min
  柱温：35℃
  用于色谱分离的溶剂梯度：
  在这些条件下，camalexin将以15分钟的保留时间洗脱（见图3）
2. 将来自HPLC的流出物直接电喷射到物料中光谱仪（Orbitrap XL发现）在全扫描MS操作分辨率R = 30,000。在质心范围内以质心模式收集数据 m/z 120-310。设置：
  电离模式：正电
  离子喷雾电压：4.5kV
  毛细管温度：250℃
  护套气体流量35（任意单位）
  Aux Ga流速25（任意单位）
3. 使用校准曲线确定camalexin的丰度方法。使用浓度的camalexin 800-400-200-100-50-25-12.5-6.25-3.12 ng/ml用于制备标准曲线解（见图4）。

代表数据

图2.样品浓度。通过通过惰性增加蒸发在样品表面上沉积气体（N 2）以除去溶剂。气体穿过气体室经由针行进到样品。

A

B

图3.来自外标的camalexin的LC-MS分析（上图）和来自植物组织（下图）。 A.总离子色谱图（TIC）。 B.正电离模式中的ESI质谱。质量的 201.048对应于camalexin的质子化形式[M + H] + sup/+的C 11 H 11 NH 2 S，（红色箭头）。

图4.卡马西平标准曲线在3.12-800ng/ml的浓度范围内获得线性标准曲线。

食谱

提取缓冲区
2-丙醇：H 2 O：HCl 37％（2:1:0.002，体积/体积/体积）。

致谢

这项工作得到了欧洲研究委员会（高级补助金233083）的支持。部分程序改变自先前描述的用于定量分析来自粗植物提取物的主要植物激素的方案（Pan等人，2010）。

参考文献

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Browne，L.M.，Conn，K.L.，Ayert，W.A.and Tewari，J.P。（1991）。 camalexins：在camelina sativa的叶片中产生的新植物抗毒素（十字花科）。 Tetrahedron 47（24）：3909-3914。
Glawischnig，E。（2007）。 Camalexin。植物化学 68（4）：401- 406。
Pan，X.，Welti，R。和Wang，X。（2010）。通过高效液相色谱 - 质谱法定量分析粗植物提取物中的主要植物激素。/a> Nat Protoc 5（6）：986-992
Tierens，K.F.J.，Thomma，B.P.，Bari，R.P.，Garmier，M.，Eggermont，K.，Brouwer，M.，Penninckx，I.A.，Broekaert，W.F.and Cammue，B。（2002）。 Esa1，一个拟南芥突变体增强对一系列坏死性真菌病原体的易感性，显示通过活性氧产生化合物的防御反应的扭曲诱导。植物J 29（2）：131-140。
Zhao，J.，Williams，C.C。和Last，R.L。（1998）。通过氨基酸饥饿，氧化应激和非生物激发剂诱导拟南芥色氨酸途径酶和卡马西平。植物细胞 10（3）：359-370。