材料和试剂

NaCl（Carl Roth，目录号：9265.1）
70％乙醇
dH 2 2 O

NaCl（Carl Roth，目录号：9265.1）

胰蛋白胨（Carl Roth，目录号：8952.3）

酵母提取物（Carl Roth，目录号：2362.2）

琼脂（Carl Roth，目录号：5210.2）

（Carl Roth，目录号：8560.1）

（Carl Roth，目录号：CN93.1）

（Carl Roth，目录号：2189.1）

NaCl（Carl Roth，目录号：9265.1）

Na 3 H 6 H 6 H 5 O 7 Na 2 SO 4 H 6 H 6 H 6 H 6 CH 4 CH 2 CH 3/Carbo Roth，目录号：3580.1）

（COONa）2（Carl Roth，目录号：4267.1）

（Carl Roth，目录号：3904.1）</b>

KCl（Carl Roth，目录号：6781.1）

NH 4 Cl（Carl Roth，目录号：K298.2）

尿素（Carl Roth，目录号：X999.3）

胰蛋白酶大豆肉汤/CASO培养基（Carl Roth，目录号：X938.1）

明胶（Carl Roth，目录号：4582.2）

NaOH（Carl Roth，目录号：6771.1）

LB介质（见配方）

LB琼脂（见配方）

人工或人尿（见配方）

设备

用于尿液过滤的蠕动泵（例如，Heidolph Instruments GmbH，型号：Pump drive 5006）

用于尿液储存器的10L聚碳酸酯杯（例如Thermo Fisher Scientific，Nalgene ，具有三个入口的聚丙烯盖的10L PC）

SARTORIUS P Midi Cap滤芯（SARTORIUS，目录号：5235307H9）

用于尿液进料的蠕动多通道泵（Watson-Marlow Pumps Group，型号：205U）

硼硅酸盐玻璃膀胱模型（图1）（Georg Becker Laboreinrichtungen GmbH& Co KG， www.laborbecker.at ）

图1.玻璃囊模型方案和尺寸包括长度和内径（ID）适应症A和定制模型B.示意图相关部分：人工膀胱隔室（1），温度控制室（2），输入连接（3）和输出（4）温度控制水回路，用于导管插入的人造尿道（5）。

带有外部水圈连接的水浴（如 LAUDA，型号：E10）

用于安装玻璃气囊型号的三脚架或其他支架（例如，Bochem Instrumente GmbH，便携式台架TG，目录号：TG500）

硅胶塞（35 mm），带6 mm分散孔

玻璃管（15cm，外径6mm = OD）
注意：我们使用1ml玻璃移液管（BRAND）。

硅胶管：2 m（ID 3 mm，OD 5 mm）

硅胶管：1 m（ID 9 mm）

硅胶管：1 m（ID 5-6 mm）

Tygon管（ID 8mm）（VWR International，目录号：228-1294）

管连接器（PP，3-5mm-6-10mm）（Bartelt，目录号：37.559）

T型连接器（PP）（ID 3 mm）（Carl Roth，目录号：E763.1）

尿道导管（所有硅胶Ch14）（BARD，目录号：153509）

10毫升注射器

排水袋（如 SARSTEDT AG，目录号：74.5220.005）

夹子（如 VWR International，目录号：229-0072）

超声波清洗机（BANDELIN电子，型号：Sonorex RK100H）

Vortex（例如，VWR International，目录号：444-0206）

推荐（作为尿液储存瓶的呼吸屏障的通气孔）（例如VWR International，目录号：28144-160）

程序

准备（第1天）

在LB培养基（1ml）中的试验菌株的过夜培养物（ONC）在37℃/180rpm下在恒温摇床中生长16小时。

高压灭菌器膀胱型号，介质瓶，滤芯，管道和为您要运行的模型数量准备的连接器在烧杯或铝箔）。

根据时间框架实验，人工尿（约700ml /天/膀胱模型）根据Stickler等人（1999）制备并通过0.45μm过滤 μm滤筒（Sartobran P）装入高压灭菌瓶（图2）。

图2.大型过滤器消毒装配体积的人造尿液。同样的程序适用于合并人尿。相关可见部件根据设备标记列表。

接种（第2天）

准备测试菌株的培养物：0.5ml ONC在20ml无菌人造尿中，在37℃/180rpm温育2-4小时。

安装加热水循环（37°C）并连接尿液供应管道。将管道插入蠕动泵（图3和图 4;图5为示意图）。

图3.连接水循环和尿液供应。水浴直接连接到膀胱模型（未示出），使用尿液从贮存器泵出蠕动泵（每个型号使用一个通道）。相关可见部件根据设备列表进行标记

图4.膀胱模型系统与三个气囊连接后的管道导管插入。相关的可视部件根据标记设备列表。

图5.关闭的示意图系统设置导尿膀胱模型所需的简单，一个膀胱没有安装设备或水浴显示。相关部件根据设备列表进行标记。

在每个膀胱插入无菌Foley导管和充气保留气球用10ml H 2 O。连接每个导管排水袋。

填充尿液供应系统和膀胱使用将蠕动泵的水平位于眼孔的正下方导管（图6; 注意：检查导管是否紧，气囊不泄漏！）停止尿液流动并夹住管道泵后。

图6.人工膀胱模型的关闭在导管插入和填充A后和培养B后。相关部件。

测量培养物的OD 600。接种适当数量的细胞为每个模型实验（取决于感兴趣的阶段你感兴趣的接种物的范围可以是例如从1×10 6到1×10 9 pfu。要这样做删除相应体积的尿液从模型并替换它相同体积的培养物。

取出夹子并启动尿液流速30-60分钟后（约30ml/h，对应于1.7rpm 使用Watson-Marlow 205U，使用5mm硅树脂管）。

定殖定量

停止尿流，混合或取样膀胱内容，并仔细将其移除至完成（将膀胱内容物转移至50ml管）。您可以使用天平（1 g〜1 ml）估算音量。

在导管从导管断开连接后，缓慢放气保持球。小心地从中取出导管膀胱并将其转移至无菌表面。切掉的尖端导管（包括眼孔）并将其转移至微量离心机管。冲洗剩余导管的内表面以除去未附着的细胞用2ml的0.9％NaCl溶液从膀胱含量或无菌尿液

切割和转移1厘米导管段到1,000微升0.9％NaCl溶液

超声膀胱内容物和盐溶液与导管片5分钟（室温，35kHz，一轮），然后再涡旋2分钟

在0.9％NaCl溶液中稀释悬浮液（膀胱至10μL，导管悬浮液至10μL-5μL）。

在LB琼脂平板（有或无选择）上稀释50-100μl稀释液

孵育后计算菌落计数以接受cfu/ml 膀胱内容物和cfu/cm导管。在竞争实验中，确定竞争性指数（所收获的CFU的比例）突变体菌株相对于例如亲本菌株的比例除以它们比例）。

代表数据

图7.随机突变对竞争性膀胱和导管定殖的影响动物导尿管膀胱模型用等量的奇异变形杆菌HI4320野生型和转座子突变体细胞HI4320mut1和HI4320mut2接种，分别。在用人造尿液灌洗24小时后，基于CFU测定人造膀胱的残余尿和内部导管表面上的群体分布。 CI值表示输出（膀胱悬浮液或导管）中突变型和野生型菌株之间的比例除以接种物中两种菌株的比例。符号表示在各个实验中获得的CI值，线表示平均CI值。

笔记

由于由于生物膜分解的不同效率，在体外模型系统中观察到高的变化，实验需要一式三份进行。用于比较两个菌株的适应性（例如野生型和突变体），推荐竞争实验（例如，在同一人工膀胱中接种两个菌株）（Reisner等人 2014）。

统计分析：使用配对t检验常规地分析独立的攻击和共同攻击实验。如果数据集不满足参数测试的必要标准，则可以应用非参数Wilcoxon匹配对测试。

食谱

Luria-Bertani肉汤（LB）和琼脂（1L）（Bertani，1951）
混合10g胰蛋白胨，5g NaCl和5g酵母提取物
将dH <2> O添加到1 L
对于LB琼脂，加入琼脂至最终浓度为1.5％
通过高压灭菌消毒并在室温下贮存

人工尿（Stickler等人，1999）
加入以下物质并溶解在预热的dH 2 O（最高40℃）中：

g/L

Na _{2 ₄} 2.30

CaCl 2 ^。 2H O
0.65

MgCl 2 ^。 6H <2> O
0.65

NaCl
4.60

Na 3 H 6 H 6 H 5 O 7 Na 2 SO 4 H 6 H 6 H 6 H 6 CH 4 CH 2 CH 3/sub> O
0.65

（COONa）₂
0.02

KH ₂ PO ₄
2.80

KCl
1.60

NH 4 Cl
1.00

尿素
25.00

通过加入NaOH片调节pH至6.1
加入明胶（5g/L），加热搅拌溶解（最高40℃液体温度）
加入高压灭菌的胰蛋白酶大豆肉汤（TSB，1g/L）以过滤尿液

致谢

实验室中的方案的建立由奥地利科学基金FWF：P21434-B18（到A.R.）资助。该协议根据先前的协议被修改和修改（Stickler等人，1999）。

参考文献

Bertani，G。（1951）。关于溶血发生的研究。 I.The mode of phage liberation by lysogenic in Escherichia coli 。 62（3）：293-300。

Stickler，D.J.，Morris，N.S.and Winters，C。（1999）。简单的物理模型，用于研究尿道导管上生物膜的形成和生理学。 Methods Enzymol 310：494-501。

Reisner，A.，Maierl，M.，Jöger，M.，Krause，R.，Berger，D.，Haid，A.，Tesic，D.and Zechner，E.L。 1型菌毛有助于导致大肠杆菌引起的导管相关性尿路感染。 >。 J Bacteriol 196（5）：931-939。