材料和试剂

外周血单核细胞（PBMC）[使用Ficoll-Paque（自己的药学）密度梯度（1.077g/cm 3 ）从健康供体的血沉棕黄层分离]
来自健康捐献者的多功能基质细胞（MSC）
Roswell Park Memorial Institute（RPMI）1640培养基（Life Technologies，目录号：31870-082）
青霉素/链霉素（5,000U/ml）（Life Technologies，目录号：15070-063）
L-谷氨酰胺（200mM）（Life Technologies，目录号：25030-024）
胎牛血清（FCS）（Greiner Bio-One GmbH，目录号：758072）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（由内部药房生产）
M-CSF（Pepro Tech，目录号：300-25）
CD14 MicroBeads（人）（Miltenyi Biotec，目录号130-050-201）
抗体
1. 抗CD14PE（BD Biosciences）
2. 抗CD206 APC（BD Biosciences）
3. 抗CD163 PerCP-Cy5.5（BioLegend）
4. 抗CD80 PE-Cy7（BioLegend）
胰蛋白酶/EDTA（0.05％，酚红）（Life Technologies，Invitrogen ^{TM，目录号：25300-054）}
培养基（见配方）
增殖培养基（参见配方）

设备

程序

MSC培养物从吸出的骨髓产生：使用Ficoll-Paque密度梯度（1.077g/cm 3）分离骨髓衍生的单核细胞，并以1.3×10 5/>细胞/cm 2在增殖培养基中。
将培养物在37℃和5％CO 2孵育。 3-4天后，除去非贴壁细胞，每3-4天更新培养基直至达到融合。使用胰蛋白酶/EDTA分离MSC单层，并以4,000个细胞/cm 2再次接种细胞以进一步扩增。
MSC（2-5代）在T75培养瓶中在汇合下在10ml培养基中培养至少3天而不更新培养基。
从培养物中吸出培养基（= MSC-CM）。在350×g下旋转MSC-CM 10分钟以获得无细胞的MSC-CM。
第0天：根据制造商的说明书，使用CD14微珠和MS柱，通过MACS从血沉棕黄层中分离来自新鲜获得的PBMC的单核细胞。
在400μl培养基中的24孔板中铺板2.5×10 6个单核细胞。
向单核细胞培养物中加入600μl无细胞MSC-CM
作为对照条件，将M-CSF以5ng/ml的浓度加入单核细胞培养物中
将培养物在37℃下在5％CO 2细胞培养箱中放置3天。
第3天：收集单核细胞。
注意：当连接单核细胞时，将板在冰上放置15分钟。
在350×g下旋转单核细胞10分钟。
加入120μlPBS，并使用血细胞计数器计数死/活细胞
用流式细胞术/分离mRNA分析单核细胞用于随访分析
1. 用于流式细胞术分析单核细胞的抗体：
  1. 抗CD14 PE
  2. 抗CD206 APC
  3. 抗CD163 PerCP-Cy5.5
  4. 抗CD80 PE-Cy7

食谱

参考文献

Melief，S.M.，Schrama，E.，Brugman，M.H.，Tiemessen，M.M.，Hoogduijn，M.J.，Fibbe，W.E.and Roelofs，H。（2013）。多功能基质细胞通过涉及单核细胞向抗炎巨噬细胞倾斜的新途径诱导人类调节性T细胞。 Stem Cells 31（9）：1980-1991。