材料和试剂

异氟烷（Vedco，目录号：50201）
Hanks平衡盐溶液（HBSS）（Cellgro，目录号：20-021-CV）
注意：10x溶液，在无菌蒸馏水中稀释至1倍。
RPMI-1640培养基（Sigma-Aldrich，目录号：R8758）
胎牛血清（FBS）（Atlanta Biologicals，目录号：S11055H）
青霉素/链霉素（Life Technologies，Gibco ，目录号：15140-122）
胶原酶IV型（Worthington Biochemical，目录号：4188）
DNase I（Sigma-Aldrich，目录号：DN25）
Percoll（GE Healthcare，目录号：17-0891-01）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）
抗CD45-别藻蓝蛋白（APC）和抗-CD11b-藻红蛋白（PE）抗体（均来自BD，目录号分别为559864和557397）
抗CD8-APC（克隆Ly-; 2）（BD，目录号：553035）
抗CD4-PE（克隆L3T4）（BD，目录号：553049）抗体
完成RPMI-1640培养基（见配方）
胶原酶和DNA酶I溶液（参见配方）
100％Percoll（见配方）
70％Percoll（见配方）
30％Percoll（见配方）

设备

剪刀和镊子
10ml和50ml一次性塑料注射器（BD）
18 G针（BD）
钢网（250μm）（VWR International，目录号：AA13478-RR）
37°C水浴
台式冷冻离心机
高速离心机（Beckman Coulter，型号：J2-21）
50 ml螺旋盖管
LSRII流式细胞仪（BD）
低速台式离心机（1,000-3,000 rpm）

程序

在感染后7天，通过异氟烷麻醉幼稚和病毒（Theiler's鼠脑脊髓炎病毒）感染的小鼠（分别为3-5对2-3）。
麻醉的小鼠用30ml无菌HBSS通过左心室使用50ml注射器经心脏灌注。
破坏小鼠和切除大脑。使用装有HBSS的10ml注射器从脊柱冲洗脊髓
使用附有橡胶的一次性注射器柱塞通过钢网将切除的大脑和脊髓单独研磨或一起研磨以制备单细胞悬浮液。
研磨的脑和脊髓经受300μg/ml IV型胶原酶加20μg/ml，并在37℃下孵育45分钟。
在室温下以630×g（1800rpm）旋转细胞悬浮液10分钟后，小心地倾析含胶原酶的上清液。

使用连续渐变隔离CNS浸润细胞
连续100％Percoll梯度用于富集CNS单核细胞。将10ml 100％Percoll加入到在完全RPMI中的20ml细胞悬浮液中，然后通过颠倒管子轻轻混合。使用J2-21离心机在25,000×g（15,000rpm）和37℃下30分钟不制动的Centifuge。通过吸出顶部15-20毫升中的细胞衰竭，收集底部三分之一的单核细胞。
转移细胞在底部Percoll梯度（10-15毫升）v底部50毫升管
用HBSS或RMPI使体积达到50ml，轻轻混合，然后在630×g（1800rpm）离心10分钟。
重悬细胞在完全RPMI培养基。
在TMEV感染后7天，从每只小鼠的脑和脊髓获得约1-2×10 6个细胞。从初始小鼠的CNS获得约2-5×10 5个细胞。

使用不连续渐变隔离CNS浸润细胞
或者，在70％和30％Percoll的界面处分离小胶质细胞和浸润性单核细胞。特别地，使用这种更确定的方法分离来自幼稚小鼠的小胶质细胞。如上所述（步骤1-6）制备的来自初始小鼠的3-5个脑和脊髓的单细胞悬浮液或来自感染小鼠的2-3个脑和脊髓经受不连续的Percoll梯度（70和30％）在2,800×g（5,000rpm）和 20℃20分钟（将细胞重悬于15ml 30％Percoll和底层20ml 70％Percoll中）。收集积聚在梯度界面中的细胞并转移到v-底50ml管中以进行洗涤。
将分离的CNS浸润单核细胞（5×10 5个）染色，并在基于FSC和SSC门控活细胞后通过流式细胞术分析（参见注释）。使用抗CD45-别藻蓝蛋白（APC）和抗-CD11b-藻红蛋白（PE）抗体来区分CNS驻留的CD45 - 小胶质细胞与浸润的CD45 - 小鼠胶质细胞，测定CD45和CD11b的表达。 /巨噬细胞的表达或其缺乏（淋巴细胞）。还使用细胞特异性标记物结合流式细胞术分离或表征特异性细胞群体例如B细胞，CD4和CD8T细胞。

图1.连续和不连续的Percoll梯度离心

代表数据

图2. TMEV感染的CNS细胞的连续Percoll梯度的代表性结果

显示了在感染后7天使用连续Percoll梯度分离的CNS浸润细胞的流式细胞术分析。

笔记

下面描述简单的流式细胞术方法。
1. 分离细胞后，使用50μl的2.4G2封闭Fc受体杂交瘤（ATCC）上清液，通过在4℃下温育30分钟。
2. 然后用别藻蓝蛋白缀合的抗CD8（克隆 Ly-2）和PE-缀合的抗CD4（克隆L3T4）在4℃下30分钟。
3. 为了可视化巨噬细胞和小胶质细胞群，细胞用PE-缀合的抗CD11b（克隆M1/70）染色别藻蓝蛋白缀合的抗CD45（克隆Ly-5）抗体。抗体在Facs缓冲液（1％FBS，0.09％叠氮化钠的PBS溶液）中稀释。后孵育，用FACS缓冲液洗涤细胞并重悬细胞在400μlFACS缓冲液中。

食谱

完成RPMI-1640培养基（100ml） 9份RPMI和1份胎牛血清加入1ml 100x青霉素/链霉素
胶原酶和DNase I溶液（100ml）将0.03g胶原酶IV和200μl（10mg/ml，在PBS中）将DNase I混合到100ml HBSS中
过滤器（0.22μm）对溶液灭菌
这些溶液是新鲜制备的，并且在每次使用时保持在4℃下
100％Percoll（10ml）混合1ml 10x PBS和9ml Percoll
70％Percoll（100ml）混合70ml 100％Percoll和30ml PBS
30％Percoll
混合30ml 100％Percoll和70ml PBS

致谢

该协议从许多以前的研究中获得，包括下面参考的工作，并且由NIH（2RO1 NS28752和NS33008）和NMSS（RG 4001A6和RG 4342A7）授权支持。

参考文献

Havenith，C.E.，Askew，D。和Walker，W.S。（1998）。小鼠常驻小胶质细胞：用天然CD ^{4分离和表征免疫调节特性} >和CD ^{8 +} T细胞。 22（4）：348-359。
Hou，W.，Jin，Y.H.，Kang，H.S.and Kim，B.S。（2014）。白细胞介素-6（IL-6）和IL-17通过抑制细胞凋亡协同促进病毒的持久性细胞毒性T细胞功能。 J Virol 88（15）：8479-8489。
Jin，Y.H.，Mohindru，M.，Kang，M.H.，Fuller，A.C.，Kang，B.，Gallo，D.and Kim，B.S。（2007）。差异病毒复制，细胞因子产生，和由Theiler's病毒感染的易感和抗性小鼠的小胶质细胞的抗原呈递功能。 81（21）：11690-11702。