材料和试剂

人或小鼠间充质干细胞（培养，处理或转染）
注意：如果使用原代骨髓干细胞（来自骨髓培养的附着细胞），最好在低通道（不超过通道3）中使用细胞; 如果使用MSC细胞系，也最好使用低通道而不是高通道。
小鼠[约8周龄的NOD.CB17-Prkdc scid/J小鼠（NOD/SCID）]
羟基磷灰石/磷酸三钙（HA/TCP）（Zimmer，目录号：60-130）
4％多聚甲醛
苏木精/伊红（H& E）染色溶液
甲酸溶液（参见配方）

设备

1 ml注射器
棉棒（Pro-Ophtha）
解释器
机架（用于在细胞培养箱中垂直固定注射器）
小鼠手术工具（解剖刀，镊子，持针器，剪刀，缝线，无菌拭子，无菌帷帘）
扫描显微镜（Leica Microsystems或任何扫描显微镜）
计算机（使用图像分析软件，如ImageJ ^®或Photoshop CS ^®）

软件

ImageJ ^®或Photoshop CS ^®

程序

准备植入物（具有HA/TCP支架的基质干细胞）
1. 取1毫升注射器，用手术刀切断尖端，让注射器尖端侧面打开，但保持活塞在内。
2. 重量40 mg羟基磷灰石（HA/TCP）并转移到每个注射器。
3. 放一个切割的棉棒，关闭注射器的开口侧。
4. 用羟基磷灰石（HA/TCP）高压灭菌注射器。
5. 取灭菌注射器和HA/TCP回细胞培养室。将注射器放在架子上（注射器必须保持垂直）。
6. 打开注射器，向每个HA/TCP支架中加入100μl10％FBS MEM培养基。混合通过1ml尖端上下移液以彻底润湿HA/TCP
7. 将MSC细胞（处理的或转染的）胰蛋白酶化并计数
8. 将在200μl培养基中的5×10 5个细胞转移到注射器中的HA/TCP中
9. 充分混合，但轻轻地用1ml吸头上下移液
10. 将具有注射器的架子放入培养箱中，37℃，5％CO 2，过夜（见图1）。
  
  图1。带注射器的机架
11. 第二天，将移植细胞在HA/TCP进入动物房。准备在小鼠皮下移植细胞
在小鼠中植入
1. NOD/SCID小鼠，在灭菌的动物室中饲养，约8周龄。每鼠标可以在四个位置（右前，左前，右后，左后）。
  注意：为了避免变化引起通过单个小鼠或植入位置，表明在每只小鼠，与对照组和实验组比较; 在每个位置，随机植入不同处理的样品。
2. 麻醉小鼠使用一般方案。让老鼠躺着放松背部上面（见图2A）。
3. 在脊柱的一侧，在背部中间刮小鼠的毛皮。乙醇对剃毛区域的皮肤进行消毒。让它干了一会儿（参见图2B）。
4. 在皮肤上切开1-1.5厘米的间隙（见图2C）。
5. 推动注射器的活塞与细胞内，以摆脱额外的介质上植入物。
6. 插入1毫升注射器与细胞在HA/TCP中的切口间隙皮肤。去皮肤下1.5厘米向前的位置从切割间隙到达前部植入位置（参见图2D-E）
7. 推动注射器的活塞，让植入物（带有细胞的HA/TCP）在皮肤下方的位置放置植入物（见图2E）
8. 慢慢地将注射器拖出，将其丢弃（参见图2F）。
9. 重复同样的步骤使用另一种植入物，这个时候让注射器插入1.5厘米背部皮肤下的背部位置切割间隙到达背部植入位置
10. 在前后植入物完成后，缝合切割皮肤（见图2G）。
11. 在鼠标背面脊柱的另一侧做同样的操作（见图2H）。
  
  图2。植入小鼠
12. 继续，直到所有的植入物放入小鼠
13. 保持小鼠温暖，并在观察房间过夜观察。
14. 然后将小鼠转移到常规喂养室（无菌动物室）。
15. 等待8周，直到植入物中的骨形成。
植入物的固定，嵌入和H& E染色
1. 牺牲老鼠，从每个位置取出每个植入物，直接固定在4％多聚甲醛过夜
2. 弃去多聚甲醛，在4℃下在甲酸中脱钙植入3天，然后在4℃保存在PBS中。
3. 使用一般方案将植入物植入石蜡中。
4. 将每个植入物切割成切片（4-μm），在植入物的不同三个位置处切割至少三个切片
5. 使用一般方案用H& E Y染色所有切片。
在显微镜下扫描切片
1. 将切片染色载玻片放在显微镜房间。
2. 在显微镜下扫描每个部分（整个部分）。
3. 将扫描的图片保存在磁盘中。
通过图像分析软件分析骨形成体积
1. 在Photoshop或其他图像分析中打开每个部分扫描图片软件。骨形成区域染色为红色（粉红色），HA/TCP 支架染色为深褐色，非分化的MSC显示为蓝色斑点。
2. 选择部分的所有红色区域（骨组织）正确的工具（如Adobe Photoshop中的"magic pen"），读出整个红色（粉色）区域的大小（像素）。然后选择整个部分区域，读出整个植入部分区域的大小（像素）。将每个部分的骨形成比计算为：
  骨量（Bv）=红色区域大小/整个区域大小
  
  图3。扫描部分
3. 对每个植入物的所有染色切片进行相同的分析。
4. 将所有的数据放在excel表中，计算平均值，标准差，并进行适当的统计分析来比较不同组之间的差异。

笔记

小鼠MSC总能达到15-30％的骨形成率; 而人MSC总是具有5-12％的骨形成比。

食谱

甲酸溶液
0.4 M甲酸
0.5M甲酸钠

参考文献

Abdallah，B.M.，Ditzel，N。和Kassem，M。（2008）。使用在体内评估骨形成能力移植试验：程序和组织分析。骨质疏松，Springer：89-100。
Chen，L.，Holmstrom，K.，Qiu，W.，Ditzel，N.，Shi，K.，Hokland，L.and Kassem，M.（2014）。 MicroRNA-34a抑制成骨细胞分化和体内人类基质的骨形成干细胞。干细胞 32（4）：902-912。