材料和试剂

设备

程序

平板T-47D和MCF7细胞在完全培养基中，让它们生长达到80％的汇合。
从培养皿中取出完全培养基，并在PBS洗涤后加入0.05％胰蛋白酶3-5分钟。一旦细胞分离，通过添加完全培养基收集细胞。
在离心（1,000xg，5分钟）后，使用血细胞计数器计数细胞，并将细胞浓度调节至2.0×10 6个细胞/ml >在完全培养基中。
小心地沉积细胞在30微升滴在100毫米的餐具盖的内侧。每个盖子可以放置至少30滴（图1A）。
将板的盖子倒置，并放置在填充有10ml PBS的板的顶部（在分配液滴后润湿培养室）（图1B）。细胞在重力作用下会聚集在悬滴的底部。确保避免将液滴靠近板边缘放置，液滴应放在足够远的地方，以免接触。
每天监测滴，孵化直到细胞片或聚集体形成，并在实验的终点通过显微镜在20分钟内的照片细胞簇。调整照明和聚焦以提供3D结构和背景之间的最大对比**。
通过广泛的末端（100微升移液器尖端切割广泛5-6毫米从末端）收集细胞群，并通过吹吸向上和向下至少7次，随后用PBS洗涤补充10％胎牛血清的洗涤。
计数使用血细胞计数器从簇释放的单个细胞

图1. 。在100mm皿盖的内侧上滴30μl; B.将盖子倒下，并在装有10ml PBS的板的顶部

代表数据

图2.来自T-47D和MCF7乳腺癌细胞系的代表性球体的照片。在悬滴中培养T-47D和MCF7细胞，并在培养后2天和4天观察到球状体的形成。

笔记

该方案同样适用于其他类型的癌细胞或遗传修饰的癌细胞（Defresne等人，2011; Yip和Cho，2013; Kumar等人，2014年， ; Teng等人，2013）。
^＃细胞浓度可能需要根据细胞大小向上或向下调整。
*如果需要，测定可以进行6天以上
**对于强制表达荧光蛋白（如GFP，RFP）或具有荧光标记的细胞使用荧光显微镜可以改善对比度并随后进行分析。

食谱

致谢

该研究部分地由国立卫生研究院授予CA120510支持。

参考文献

Defresne，F.，Bouzin，C.，Grandjean，M.，Dieu，M.，Raes，M.，Hatzopoulos，A.K.，Kupatt，C.and Feron，预处理的内皮祖细胞通过SPARC驱动的细胞 - 细胞相互作用和内吞作用减少黑素瘤转移的形成。/a> Cancer Res 71（14）：4748-4757
Kumar，A.，Fan，D.，Dipette，D.J.and Singh，U.S.（2014）。 Sparstolonin B，一种新型植物衍生化合物，可抑制细胞周期并在N-myc扩增中诱导凋亡N-myc非扩增的神经母细胞瘤细胞。 9（5）：e96343。
Teng，Y.，Mei，Y.，Hawthorn，L。和Cowell，J。（2013）。 WASF3通过抑制KISS1调节ZEB1的miR-200失活，导致增加乳腺癌细胞的侵袭性。癌基因 33（2）：203-211。
Yip，D.和Cho，C.H。（2013）。用于抗癌药物测试的胶原凝胶中肝肿瘤和基质细胞的多细胞3D异形体模型。 Biochem Biophys Res Commun 433（3）：327-332。