材料和试剂

要测试的纯化蛋白质
注意：任何类型的缓冲液可用于制备蛋白质样品。我们已经测试了磷酸钠和Tris缓冲液。
（PerkinElmer，目录号：BLU006X250UC）[γ-32 P] -GTP（800Ci/mmol，10mCi/ml，250μCi）
c-di-GMP unlabeled（Axxora）
GTP（Sigma-Aldrich，目录号：51120）
纯化的二鸟苷酸环化酶[WspR（R242A突变体），P。铜绿（Sambanthamoorthy ，2012）]
南极磷酸酶（New England Biolabs，目录号：M0289S）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A9418）
用于蛋白质浓度估计的Bradford试剂（Bio-Rad Laboratories，目录号：500-0205）
Safety-Solve ^TM完全计数鸡尾酒（RPI，目录号：111177）
蛋白质纯化缓冲液（参见配方）
绑定缓冲区（参见配方）

设备

硝化纤维素纸（0.2μm）（Whatman，Optitran ，目录号：BA-S 83）
Whatman滤纸（Whatman，目录号：3MM）
包含离心机和加热块的放射性工作区域
闪烁瓶（20ml，具有Poly螺旋盖，500的情况）（PerkinElmer，Econo Glass Vial，目录号：6000097）
闪烁计数器（Beckman Coulter，型号：LS 6500）
Biorad槽印迹（Hybri Dot Manifold）（Bristol Robotics Laboratory，目录号：1050MM）
1.5 ml eppendorf管
过滤提示
镊子和剪刀

软件

GraphPad Prism 5.0

程序

使用制造商的说明书纯化待测试的蛋白质。我们使用该测定来测试对6x HIS标记的蛋白（从pET28b载体克隆和表达）和未标记的蛋白（从pTXB1克隆和表达）的结合。使用Bradford测定法（Bio-Rad Laboratories）对纯化的蛋白质进行定量。
应该包括已知结合c-di-GMP的阳性对照蛋白，例如来自大肠杆菌的YcgR。阳性对照的纯化类似于测试蛋白进行。 BSA可用作阴性对照。
放射性标记的c-di-GMP使用具有[α-32 P] -GTP作为底物的纯化的二鸟苷酸环化酶合成。我们已经成功地使用来自绿脓假单胞菌的GGDEF蛋白的WspR（R242A突变体）用于c-di-GMP合成（Sambanthamoorthy等人，2012）。如（Hunter et al。，2014）所述测试酶的活性。
在开始实验之前，应制备所有缓冲液，并如下所述调节至适当的pH。

标记的c-di-GMP的合成

解冻[α-^{32 P] -GTP。}

c-di-GMP合成的反应如下所示：

组分	体积（μl）
NaCl（1M）	2.05
Tris（1M，pH 7.6）	1.2
（Mg）2/MgCl 2（1M）	0.25
[α-32 P] -GTP或未标记的GTP（12.5μM）	42.5
WspR *	〜100μM

*预先确定酶的活性以评估待添加的量反应的总体积为50μl

使用未标记的c-di-GMP的反应并行进行反应使用标记的c-di-GMP进行随后的定量反应效率。
将反应在室温下温育过夜。
向反应中加入1μl的南极磷酸酶（NEB）以水解剩余的[α-32 P] -GTP。
将反应在100℃下煮沸10分钟并沉淀蛋白质通过在室温下以16,000×g离心10分钟除去温度，然后除去上清液
将反应物转移到另一个eppendorf管中，并在-20℃下储存，直到进一步使用。

使用如先前所述的超高压液相色谱（UPLC）串联质谱（MS-MS）测量未标记的对照反应中c-di-GMP的浓度（Massie等人， 2012）。假定标记的反应是等效的。通常，体外二瓜氨酸环化酶反应基于c-di-GMP的起始浓度产生接近100％的最大产量。
对于结合反应，将100-500nM蛋白与如下所示的20μl体积中的不同量的[32 P] -c-二-GMP（0.125μM至1.5μM）温育30分钟。使用的标记的c-di-GMP的范围取决于测试蛋白的特定结合参数。每个样品一式两份测试。包括等量的YcgR和BSA作为阳性和阴性对照。

组分
量/体积（μl）

蛋白质
100-500 nM

绑定缓冲区
5

[α-³² P] c-di-GMP
0.125μM至1.5μM

水
最多20μl
当结合反应孵育时，制备狭缝印迹装置。将硝酸纤维素膜和Whatman滤纸切割成斑点印迹组件的尺寸。将膜和滤纸短暂地浸入结合缓冲液中以润湿它们。将斑点印迹装置连接到真空，并将膜和滤纸放置在孔侧并打开真空。然后通过牢固地拧入装置的顶层来完成组件。这保证了设备的正确的真空密封

图1. Hybri点歧管组件
然后通过真空斑点印迹将制剂装载到硝酸纤维素膜上。装载在斑点印迹上的样品应该很好地分离（样品孔每侧上的一个孔应该是空的）。在装载前应标记印迹的方向。这防止在处理步骤期间污染计数。在样品加载5分钟后，用3ml结合缓冲液（每次加入200μl结合缓冲液， 15次洗涤），以洗去未结合的[32 P] -c-二-GMP。在洗涤后保持真空5分钟以干燥组件。
然后将膜从组件中取出并在干燥的滤纸上干燥15分钟，将含有样品的斑点切成方块，并加入到闪烁瓶中的5ml闪烁液中。
通过液体闪烁计数（cpm/min）对各孔的结合的[32 P] -c-di-GMP进行定量。
对于使用未标记的c-di-GMP和GTP的竞争实验，在蛋白质与[32 P] -c-二-GMP孵育15分钟后，将3μM未标记的核苷酸（未标记的c- GMP和GTP），并将反应物再温育15分钟并类似地处理
使用非线性回归分析，使用GraphPad Prism 5.0分析来自结合实验的数据[代表性实验显示在Srivastava等人（2013）]。

代表数据

代表性实验证明c-di-GMP结合于V。霍乱弧菌转录因子FlrA在Srivastava等人（2013）中显示。

笔记

我们已经测试这种协议的转录因子，大多是细胞质蛋白。但是，在原则上，这个协议应该适用于任何细菌蛋白质
为了确保槽缝印刷组件安全紧固，使用稀释的染色溶液（如溴酚蓝）穿过几个散置的孔。如果狭缝印迹很好地密封并且在孔之间不发生渗出，则颜色应当保持在孔内并且不扩散。

食谱

蛋白纯化缓冲液
按照制造商的指示
绑定缓冲区
10mM MgCl 2/
20mM Tris（pH7.8）
50mM NaCl

致谢

该方案被修改和改编自先前描述的结合测定（Hickman和Harwood，2008）。

参考文献

Hengge，R。（2009）。细菌中c-di-GMP信号传导的原理。 Nat Rev Microbiol 7（4）：263-273。
Hickman，J.W。和Harwood，C.S。（2008）。从绿脓假单胞菌中鉴定FleQ作为c-di-GMP- response transcription factor。 Mol Microbiol 69（2）：376-389
Hunter，J.L.，Severin，G.B.，Koestler，B.J.and Waters，C.M。（2014）。霍乱弧菌二鸟苷酸环化酶VCA0965具有AGDEF活性位点并合成环状di-GMP。 BMC Microbiol 14：22.
Massie，J.P.，Reynolds，E.L.，Koestler，B.J.，Cong，J.P.，Agostoni，M.and Waters，C.M。（2012）。高特异性循环二乙烯化物信号的定量。美国国家科学院 109（31）：12746-12751。
Ryjenkov，D.A.，Simm，R.，Römling，U。和Gomelsky，M。（2006）。 PilZ域是第二个信使的受体c-di-GMP THE PilZ DOMAIN 蛋白YcgR控制肠球菌的运动性。 J Biol Chem 281（41）：30310-30314。
Sambanthamoorthy，K.，Sloup，R.E.，Parashar，V.，Smith，J.M.，Kim，E.E.，Semmelhack，M.F.，Neiditch，M.B.and Waters，C.M。（2012）。拮抗双胍酸环化酶抑制生物膜形成的小分子的鉴定。 em> Antimicrob Agents Ch 56（10）：5202-5211。
Srivastava，D.，Hsieh，M.L.，Khataokar，A.，Neiditch，M.B.and Waters，C.M。（2013）。循环di-GMP通过抑制转录诱导而抑制霍乱弧菌的运动性，诱导细胞外多糖生产。 Mol Microbiol 90（6）：1262-1276。
Weinhouse，H.，Sapir，S.，Amikam，D.，Shilo，Y.，Volman，G.，Ohana，P.and Benziman，M。（1997）。 c-di-GMP结合蛋白，调节木醋杆菌中纤维素合成的新因子。 FEBS Lett 416（2）：207-211。