材料和试剂

20 mM ATP
[γ-32 P] ATP（5,000Ci/mmol，10mCi/ml）（同位素研究所，目录号：SBP-401）
λ蛋白磷酸酶（New England Biolabs，目录号：P0753S）
直链淀粉树脂（New England Biolabs，目录号：E8021）
COSMOGEL His-Accept（Nacalai Tesque，目录号：08368-12）
谷胱甘肽琼脂糖4B（GE Healthcare，目录号：17-0756-01）
Phos标记丙烯酰胺（Wako Pure Chemical Industries，目录号：304-93521）
宽视觉预染蛋白质大小标记物III（Wako Pure Chemical Industries，目录号：230-02461）
His 标签单克隆抗体（Merck Millipore，目录号：70796-4CN）
苯基甲磺酰氟（PMSF）
透析缓冲液（参见配方）
10x磷酸化缓冲液（见配方）
绑定缓冲区（参见配方）
脱磷酸缓冲液（参见配方）
2x SDS蛋白样品缓冲液（见配方）

设备

1.5 ml微量离心管
冷藏微量离心机
微量旋转器
GELoader尖端0.5-20μl（Eppendorf，目录号：0030001.222）
热块
SDS-PAGE装置
凝胶转移装置
电源
振动器
磷光仪
化学发光成像系统

程序

重组蛋白的制备
1. 在分别含有pMALc2-RSG，pET16b-14-3-3或pGEX 4T-1-NtCDPK1的大肠杆菌中表达MBP-RSG，His-14-3-3和GST-NtCDPK1，如参考文献中所述（Ishida等人，2008; Ito等人，2010; Ito 等人，2014）。
2. MBP-RSG，His-14-3-3和GST-NtCDPK1 通过使用直链淀粉树脂，COSMOGEL His-Accept或谷胱甘肽纯化根据手册的Sepharose 4B（pMAL TM supra蛋白融合& 纯化系统，Ni-NTA His Bind树脂或GST基因融合系统手册）。
3. 将纯化的蛋白质分别用500-1,000倍体积的冰冷的透析缓冲液透析过夜
4. 甘油，相当于40％体积的透析蛋白溶液，加入到透析的蛋白质溶液中大约50％（v/v）甘油（最终浓度）和蛋白质溶液储存在-20℃。
  注意：透析过的蛋白质溶液含有约30％（v/v）甘油。
NtCDPK1对RSG的磷酸化
1. 使用以下步骤在每个1.5ml微量离心管中制备反应混合物：
  5μl10x磷酸化缓冲液
  5μl1％（v/v）β-巯基乙醇（即将使用前稀释）
  含有或不含有1μl[γ-32 P] ATP（5,000μCi/mmol，10mCi/ml）的2.5μl20mM ATP，
  2μgMBP-RSG
  100 ng GST-NtCDPK1
  H sub 2 O最多50μl
2. 混合并将反应混合物在30℃下孵育1小时。
14-3-3与磷酸化RSG结合
1. 轻轻倒转直链淀粉树脂的容器以重悬浆料
2. 转移30微升重悬浮浆液到每个1.5毫升微量离心管。
3. 向每个微量离心管中加入1ml冰冷的结合缓冲液以平衡树脂使用
4. 在4℃下，将树脂以1,000×g 旋转几秒钟
5. 小心取出并弃去上清液。
6. 重复步骤C3-5两次，共三次洗涤。
7. 加入250μl冰冷的结合缓冲液，所有（50μl）的反应混合物将RSG和3μgHis-14-3-3磷酸化到树脂上
8. 在微量管旋转器上在4℃下轻轻混合混合物30分钟，以将MBP-RSG结合到直链淀粉树脂和His-14-3-3上。
9. 在4℃下将树脂以1,000×g离心几秒钟。
10. 小心取出并弃去上清液。
11. 用1ml冰冷的结合缓冲液洗涤树脂以除去ATP和未结合的蛋白质
12. 通过倒置管子几次轻轻混合。
13. 在4℃下将树脂以1,000×g离心几秒钟。
14. 小心取出并弃去上清液。
15. 重复步骤C11-14三次，共四次洗涤。
16. 使用配有GELoader Tips的微量移液器完全除去上清液。
RSG由λ蛋白磷酸酶脱磷酸化
1. 向树脂中加入200μl冰冷的去磷酸化缓冲液和1μl（400U）λ蛋白磷酸酶。
2. 在微量管旋转器上在4℃下轻轻混合混合物30分钟。
3. 用1ml冰冷的结合缓冲液从树脂洗涤未结合的蛋白质
4. 通过倒置管子几次轻轻混合。
5. 在4℃下，将树脂以1,000×g 旋转几秒钟
6. 小心取出并弃去上清液。
7. 重复步骤D3-6三次，共四次洗涤。
8. 通过使用配有GELoader尖端的微量移液器完全去除上清液。
检测RSG的磷酸化状态
1. 向树脂中加入60μl2×SDS蛋白质样品缓冲液
2. 在95℃加热块中加热管5分钟以使蛋白质变性
3. 加载25微升的上清液和3微升的蛋白质大小标记和进行Phos-tag SDS-PAGE（Kinoshita和Kinoshita-Kikuta，2011）检测用冷的ATP磷酸化的MBP-RSG或正常的SDS-PAGE 用于检测用[γ-32 P] ATP磷酸化的MBP-RSG
4. 对Phos-tag SDS-PAGE凝胶进行考马斯亮蓝（CBB）染色以检查用磷酸化的MBP-RSG的磷酸化状态冷ATP。
5. 检测MBP-RSG的磷酸化状态用[γ-32 P] ATP磷酸化，干燥SDS-PAGE凝胶，成像板在干凝胶上。暴露一夜，以可视化放射性信号。通过使用成像系统扫描成像板， Typhoon FLA 9500.
6. 用抗14-3-3进行免疫印迹分析（Igarashi等人，2001）抗体或抗His标签单克隆抗体通过使用成像检测His-14-3-3结合到MBP-RSG 系统，ImageQuant LAS 4000。

代表数据

图1.RSG中Ser-114的磷酸化状态受λ蛋白磷酸酶14-3-3保护。用冷ATP磷酸化的MBP-RSG蛋白在Phos-tag SDS-PAGE上解析，通过考马斯观察亮蓝（CBB）染色。用[γ-32 P] ATP磷酸化的MBP-RSG蛋白在SDS-PAGE上分辨并使用成像系统检测。 RSG的几个氨基酸被NtCDPK1磷酸化。当His-14-3-3不结合MBP-RSG时，RSG的磷酸基团被λ蛋白磷酸酶完全去除。另一方面，当用λ蛋白磷酸酶处理结合His-14-3-3的MBP-RSG时，RSG中的Ser-114的磷酸化状态受到保护而不受λ蛋白磷酸酶的影响。顶部，中间和底部的箭头分别表示多磷酸化，Ser-114磷酸化和去磷酸化的MBP-RSG。有关详情，请参阅Ito 等（2014）。

笔记

我们使用λ蛋白磷酸酶，但不是细菌碱性磷酸酶用于该测定，因为14-3-3倾向于在碱性条件下从RSG解离。如果碱性条件不导致靶蛋白复合物的解离，细菌碱性磷酸酶可用于该测定
不同蛋白质之间稳定的蛋白质 - 蛋白质相互作用的条件不同。通过改变pH水平，NaCl（KCl）浓度和洗涤剂类型和浓度可以发现目标蛋白质 - 蛋白质相互作用的最佳缓冲条件。
在磷酸化或脱磷酸化过量或不足的情况下，改变反应时间或激酶和磷酸酶的量可获得满意的结果。

食谱

透析缓冲液
25mM Tris-HCl（pH7.5，4℃） 150mM NaCl 0.1％（v/v）Triton X-100 30％（v/v）甘油 0.05％（v/v）β-巯基乙醇 0.1mM PMSF
注意：在使用前立即加入β-巯基乙醇和PMSF。
10x磷酸化缓冲液
200mM Tris-HCl（室温下pH7.5）
100 mM NaCl
1％（v/v）Triton X-100 5mM CaCl 2
绑定缓冲区
25mM MOPS-NaOH（pH7.0，4℃） 25mM NaCl 0.1％（v/v）Triton X-100 0.05％（v/v）β-巯基乙醇 0.1mM PMSF
注意：在使用前立即加入β-巯基乙醇和PMSF。
脱磷酸化缓冲液
25mM MOPS-NaOH（pH7.0，4℃） 25mM NaCl 0.1％（v/v）Triton X-100 1mM MnCl 2
0.05％（v/v）β-巯基乙醇 0.1mM PMSF
注意：在使用前立即加入β-巯基乙醇和PMSF。
2x SDS蛋白样品缓冲液
250mM Tris-HCl（室温下pH6.8）
4.0％（w/v）SDS
20％（v/v）甘油 0.02％（w/v）溴酚蓝
10％（v/v）β-巯基乙醇注意：在使用前立即加入β-巯基乙醇。

致谢

这项工作得到日本科学促进会（授予日本科学技术协会23657038号）和日本教育，文化，体育，科学和技术部（授予Y。的授权号24118004）的支持。

参考文献

Igarashi，D.，Ishida，S.，Fukazawa，J.and Takahashi，Y。（2001）。 14-3-3蛋白调节bZIP转录激活剂RSG的细胞内定位。 em> Plant Cell 13（11）：2483-2497。
Ishida，S.，Yuasa，T.，Nakata，M.and Takahashi，Y。（2008）。烟草钙依赖性蛋白激酶CDPK1调节转录因子REPRESSION OF SHOOT GROWTH以响应gibberellins。 Plant Cell 20（12）：3273-3288。
Ito，T.，Nakata，M.，Fukazawa，J.，Ishida，S.and Takahashi，Y。（2010）。底物特异性的改变：烟草Ca（2+）依赖性蛋白的可变N末端结构域激酶对底物识别是重要的。植物细胞22（5）：1592-1604。
Ito，T.，Nakata，M.，Fukazawa，J.，Ishida，S.and Takahashi，Y。（2014）。 Ca ^{2 +}依赖性蛋白激酶的支架功能：烟草 Ca ^{2 +} -DEPENDENT PROTEIN KINASE1将14-3-3转移到底物磷酸化后的生长生长代谢植物生理165（4）：1737- 1750。
Kinoshita，E。和Kinoshita-Kikuta，E。（2011）。在中性pH条件下改进的Phos-tag SDS-PAGE，用于高级蛋白磷酸化分析。 Proteomics 11（2）：319-323。