材料和试剂

C57BL6小鼠（Mus musculus）
异氟烷（Isothesia）（Butler动物用品）
氯化钠（NaCl）（Thermo Fisher Scientific，目录号：S-271）
氯化钾（KCl）（Thermo Fisher Scientific，目录号：P217-500）
碳酸氢钠（NaHCO 3）（Thermo Fisher Scientific，目录号：S233-500）
磷酸一钠（NaH 2 PO 4）（Thermo Fisher Scientific，目录号：S369-500）
硫酸镁七水合物（MgSO 4·7H 2 O 7H 2 O）（Thermo Fisher Scientific，目录号：MG63-500）
氯化钙（CaCl 2）（Thermo Fisher Scientific，目录号：C79-500）
右旋糖（Thermo Fisher Scientific，目录号：D16-500）
蔗糖（Thermo Fisher Scientific，目录号：S5-3）
放射免疫沉淀测定（RIPA）裂解缓冲液（参见配方）
Roche完全蛋白酶抑制剂混合物颗粒（Roche Diagnostics，目录号：11697498001）
蛋白酶抑制剂（Sigma-Aldrich，目录号：p8340）
磷酸酶抑制剂（Sigma-Aldrich，目录号：3 p0044）
疯狂胶水
Millipore抗GluA1抗体（Millipore，目录号：ab1504）
细胞信号抗兔HRP抗体（Cell Signaling Technology，目录号：7074S）
琼脂粉（Alfa Aesar，目录号：A10752）
人工脑脊液（ASCF）（见配方）
高镁ACSF（参见配方）
琼脂块（见配方）
蔗糖培养基（参见食谱）

设备

徕卡vibratome S1000
剪刀（一大一小）
镊子
锋利刀片
Vibratome喷油器叶片（Leica）
1.5 ml Eppendorf管
颗粒杵电机手持式匀浆器（Kontes，目录号：749540-0000）
4ºC台式离心机
标尺
有氧空气混合物（Lindweld Alloy，型号：MAA140）
网格方形培养皿（Thermo Fisher Scientific，目录号：FB0875711A）
超声波仪（Thermo Fisher Scientific）

程序

注意：对动物进行相关行为模式的训练。对于我们的实验，我们使用电机前肢达成任务（Padmashri等，2013）。可以采用所描述的技术来评估与特定行为范例相关的任何脑区域中的突触变化。

突触体准备
1. 准备新鲜的人工脑脊液（1x ACSF）和泡泡好氧空气混合物在室温下至少15分钟
2. 制备4mM MgSO 4 ACSF（高Mg 2+和ACSF），并保持在恒定鼓泡的冰浴中。
3. 麻醉动物使用异氟烷气体和安乐死通过断头
4. 做一个锋利的切口通过皮肤顶部的头骨。将皮肤与骨骼分开。
5. 从Foramen Magna到顶部做一个直线切口头骨。分开颅骨的两个部分暴露大脑。
6. 用约1ml冷的高Mg 2+ + ACSF清洗脑。
7. 隔离大脑和横向布局（图1C）。切断小脑和嗅球（图1D）。站在大脑上尾侧并切除脑的腹侧部分（图1E）。
8. 使用a胶粘在vibratome板上的大脑的尾部长方形琼脂作为支持物（图1F）。确保大脑是在切片期间（图1G）浸没在冰冷的高Mg 2+ + ACSF下。高 Mg ^{2 + 使用ACSF，因为这通过阻断防止对神经元的兴奋性毒性 N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDAR）。}
9. 使薄冠状直到来自两个半球的胼heres体连接（图1））。然后做两个750微米冠状切片现在包含主运动皮质M1（前1毫米和后0.5毫米前囟和0.75至2.5毫米侧）
10. 在室温下在ACSF的浸没室中孵育切片1小时，同时恒定鼓泡
11. 孵育后，将脑切片放在ASCF下的培养皿中并在室温下恒定鼓泡。使用刀片隔离前肢区域的主运动皮层通过切割0.75和2.5毫米横向于中线（图1I）。
12. 将脑组织放入 1.5ml Eppendorf管，含有300μl0.32M蔗糖培养基1（见含有蛋白酶抑制剂（1片，在50ml培养基中））
13. 用手持式匀浆器匀化一分钟，上下运动。
14. 在4℃下以1,500rpm旋转均质化的样品10分钟。获得的沉淀物含有核和细胞碎片舍弃。
15. 收集含有悬浮的突触体的上清液，并在4℃下以13,500rpm旋转20分钟。
16. 获得的丸是所需的突触体制剂。
  注意：所获得的制剂是大约70％富集的突触体的制备。该制剂有污染线粒体和来自内质网细胞器的碎片。至准备更准确的形式的突触体这个准备将有通过蔗糖或percoll梯度，并且还没有
  
  图1.在vibratome上制备脑切片
  
  图2.具有pre和的突触体的电子显微镜图像从所述方案获得的突触后组分（比例尺1 微米）
评估突触GluA1变化
1. 吸出步骤A14的上清液。
2. 将沉淀重悬在200μlRIPA裂解缓冲液中
3. 通过在冰上超声处理制备物（由于细胞碎片不显着，不需要裂解后旋转）
4. 通过相关蛋白质估计方案（来自Pierce的BCA测定）估计蛋白质水平
5. 运行蛋白质裂解物使用标准的蛋白质印迹技术。我们为我们的实验运行20微克蛋白质。
6. 对于免疫印迹，使用Millipore抗GluA1以1：1,500稀释一级抗体和细胞信号抗兔HRP作为次级抗体以1:5,000稀释。

代表数据

图3.来自运动技能训练的小鼠的训练（tr）和未训练（utr）半球的前肢M1区域的突触GluA1的代表性蛋白质印迹。在运动技能训练中，突触GluA1在前肢运动皮层区域训练后。为了定量，将GluA1水平标准化为GAPDH。

注意：我们已经评估了这些制剂中的其他蛋白质，如mTOR，ERK，PSD-95，GLuA2，MAP2。

食谱

人工脑脊液（ASCF）

化学品	浓度（mM）：	g/L
氯化钠（NaCl）	126	7.365
氯化钾（KCl）	3	0.2235
磷酸一钠（NaH 2 PO 4）	1.25	0.1725
碳酸氢钠（NaHCO 3）	26	2.185
硫酸镁七水合物（MgSO 4）7H/7H 2 O）	1	0.120
氯化钙二水合物（CaCl 2 ^。 2H O）	2	0.294
葡萄糖	10	1.8
水	弥补1 L
pH	7.4
强度	300 mmoles/kg

/em> 和右旋糖，并在4°C储存。在实验之前，制备1×ACSF，并加入葡萄糖，镁和钙盐。准备了两个MgSO ₄ 和CaCl ₂ 并作为1M储备储存，然后以所需体积加入1x ACSF。需要注意的是，1x ACSF是有力的鼓泡至少15分钟，然后加入CaCl 2 以防止钙沉淀。另一种方法是在剧烈搅拌下在搅拌盘上小量加入CaCl _{2 。}

高镁ACSF

化学品

ACSF
1x解决方案
1 L

硫酸镁七水合物（MgSO 4）7H/7H 2 O）
4 mM
0.984 g/L

注意：高镁ACSF用于阻断NMDA受体通道并防止由于兴奋性毒性引起的细胞死亡。将Mg ^{2 +} 制备为1M储备液和0.15ml 1M Mg 4 将终浓度为4mM的Mg sup> 。
琼脂块

化学品
重量（g）

琼脂粉
33.2

氯化钠
9

水
弥补1 L

将NaCl和琼脂粉末分散在水中。在微波炉中加热，直到所有的琼脂溶解并得到澄清的溶液。倒入方形培养皿，让其冷却，得到琼脂块。从块中制作小矩形，并将矩形的宽度粘贴在vibratome板上。
蔗糖培养基1

解决方案
卷

2.5 M蔗糖 6.4 ml

0.5 M HEPES（pH 7.5）
500微升

0.5 M EDTA（pH 8.0）
10微升

水
43.09毫升

蔗糖培养基储存在-20℃。 Roche蛋白酶抑制剂混合物片剂在使用前加入到培养基中（1片在50ml中）

RIPA裂解缓冲液

成分	重量或体积
Tris ^。 HCl	0.3 g
氯化钠	0.44克
十二烷基硫酸钠	0.05 g
脱氧胆酸钠	0.125克
Triton X 100	0.1 ml
0.5 M EDTA	0.05 ml
水	补足至50ml ml
pH	7.4

注意：裂解缓冲液在室温下储存。在使用前，加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂（10μl至1ml裂解缓冲液）。裂解缓冲液储存在4℃下，并在制备后2天内使用。

致谢

这项工作得到国家儿童健康和人类发展研究所R01 HD67218（A.D.）的支持。我们感谢Gurudutt Pendyala博士在建立协议方面的宝贵见解，以及Padmashri Ragunathan博士对手稿的意见。描述的方案从以前的出版物（Weiler等人，1981）修改以测量具有行为的小鼠皮质的离散区域中的突触蛋白质变化。

参考文献

Padmashri，R.，Reiner，B.C.，Suresh，A.，Spartz，E.and Dunaevsky，A。（2013）。改变结构和功能突触可塑性与运动技能学习在脆弱X综合征的小鼠模型。 a> J Neurosci 33（50）：19715-19723。
Weiler，M.H.，Gundersen，C.B。和Jenden，D.J。（1981）。突触体中的胆碱吸收和乙酰胆碱合成：使用两种不同标记的胆碱变体进行的研究。 J Neurochem 36（5）：1802-1812。