材料和试剂

蔗糖（United States Biological，目录号：21938）
Tris碱（United States Biological，目录号：75825）
HCl（发烟，37％）（Merck KGaA，目录号：100317）
EDTA（United States Biological，目录号：15699）
KCl（SERVA，目录号：26868）
2-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M6250）
苯酚（Merck KGaA，目录号：100206）
NH 4 OAc（Merck KGaA，目录号：101116）
100％MeOH（J.T.Baker，，目录号：9093-03）
Urea（United States Biological，目录号：75826）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T9284）
（Merck KGaA，目录号：106683）
L-赖氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：L5501）
DTT（Merck KGaA，目录号：111474）
提取缓冲液（参见配方）
溶解缓冲液（参见配方）
0.1M NH 4 OAc在100％MeOH中的溶液（参见配方）

设备

陶瓷砂浆和杵
烧杯
搅拌棒
离心机（Eppendorf，型号：5424）
AVANTI ^® J-26 XP高性能离心机，配备JA 25.50固定角转子（Beckman Coulter）
COREX 管，DuPont Instruments（目录号：00152）
1.5 ml Eppendorf管
通风橱
高速真空（Savant Systems LLC，型号：SC110）
混合器（Vortex Genie 2，Scientific Industries，Inc。）
搅拌器（Corning）

程序

百合植物组织收集
1. 年轻百合植物的各种植物和花器官，包括收集长度约4cm的花芽。前三个轮子的年轻叶子在芽附近，加上整个根（距离顶点约8cm）也被收集
2. 在现场从百合植物中分离每个器官，并立即在液氮中冷冻并储存在-80℃。
均质化
1. 在通风橱工作。将液氮加入研钵（12.5厘米）中，并杵保持冷冻
2. 添加并研磨1克新鲜或冷冻的组织成粉末冷冻的研钵和杵在液氮中。保持样品冷冻一直。
3. 向样品粉中加入5毫升水饱和的苯酚和5毫升提取缓冲液
4. 向砂浆中加入更多的液氮，以便于研磨和混合植物样品。重复一次。
5. 将冷冻的样品混合物留在研钵中，直到其熔化并变成浆料。
6. 一旦变成浆料，就要剧烈地研磨样品混合物
  
  视频1 。百合植物组织的均质化
7. 将熔融溶液转移到玻璃烧杯中（25或50ml）体积），并在室温下用搅拌棒轻轻混合30分钟。
相分离 - 将蛋白质分配到苯酚相中
1. 将样品混合物转移到COREX 管中
2. 在4℃下以10,000rpm离心10分钟
3. 将上层相（苯酚相）转移到新的50ml管中
4. 向水相中加入等体积的苯酚
5. 通过剧烈涡旋混合彻底1分钟。
6. 在4℃下以10,000rpm离心10分钟
7. 取出并混合上层相（苯酚相）。
相分离 - 从苯酚相中重复去除污染物
1. 向混合的苯酚相中加入等体积的提取缓冲液
2. 在4℃下以10,000rpm离心10分钟
3. 将上层相（苯酚相）转移到新的50ml管中。
蛋白沉淀
1. 在100％MeOH（冷的）中加入5倍体积的0.1M NH 4 OAc，并通过涡旋混合1分钟。
2. 在-20℃下沉淀蛋白2小时或过夜（约16小时）（注2）
3. 在4℃下以10,000rpm离心10分钟
4. 倾析上清液。
蛋白洗涤
1. 向蛋白质沉淀中加入在100％MeOH（冷）中的10ml 0.1M NH 4 OAc。
2. 通过剧烈涡旋洗涤沉淀
3. 在4℃下以10,000rpm离心10分钟。
4. 重复洗涤步骤两次。
5. 滗析上清液。
6. 加入10ml丙酮。
7. 在4℃下以10,000rpm离心10分钟
8. 重复洗涤步骤两次。
9. 丸粒用速度真空短时间干燥30-60秒。
10. 将沉淀溶解在300-500μl（注3）溶解缓冲液中通过涡旋混合30分钟。如果丸是大的，打破它用玻璃棒下降成小块，以增加蛋白质溶解度。
11. 在4℃下以10,000rpm离心10分钟
12. 收集上清液（蛋白质）。将管中的沉淀（注4）重新溶解在300-500μl溶解缓冲液中
13. 这种蛋白质溶解过程可以重复几次直到溶解缓冲液中的蛋白质浓度变为无效。
14. 可以将收集的上清液合并在一起。

代表数据

图1.通过SDS-PAGE的百合蛋白的花药特异性分析从L的各种器官中分离总蛋白（40μg）。通过12％SDS-PAGE分离并用考马斯蓝染色。 1，根; 2，茎; 3，叶; 4，tepal; 5，细丝; 6，花药; 7，雌蕊; M，标记。

图2.百合花粉蛋白的2D-PAGE分析从L的花粉分离总蛋白（1.5mg）。通过2D-PAGE分离并用考马斯蓝染色。标记蛋白在左侧显示。

食谱

提取缓冲区

	10 ml	最终浓度
蔗糖	2.4克	0.7 M
Tris碱	0.61克	0.5 M
EDTA	0.19克	50 mM
HCl发烟37％	24.8微升	30 mM
1.0 M KCl	1 ml	100 mM
2-巯基乙醇	200μl	2％

然后将ddH sub 2 O填充至10ml。

溶解缓冲区

	3 ml	最终浓度
尿素	1.7克	9.5 M
10％Triton X-100	600μl	2％
2.5 M K sub 2 CO 3	6微升	5 mM
L-赖氨酸	1.5 mg	500μg/ml
1 M（15.4％）DTT	97.4μl	0.5％

ddH 2 O加入到3ml体积中，过滤灭菌（0.22μm），分装并储存在-20℃。

0.1M NH 4 OAc在100％MeOH中的溶液将0.771g的NH 4 OAc（MW = 77.08）加入到100ml的100％MeOH中

笔记

根据我们的经验，使用基于苯酚的总蛋白提取方法从拟南芥和烟草植物的各种器官提取的总蛋白产生高质量的蛋白质。
在-20℃下沉淀过夜（约16小时）的蛋白质可允许更好的总蛋白产量。然而，如果产量不是问题，大多数蛋白质可以在-20℃下沉淀2小时
由于2D-PAGE的等电聚焦中样品上样量的最大值约为100μl，因此重要的是保持蛋白质样品在高浓度（至少15μg/μl）。如果仅为SDS-PAGE制备蛋白质，可以使用更大体积的溶解缓冲液
可以用溶解缓冲液溶解沉淀中的蛋白质。然而，离心后不溶物可能留在沉淀中。

致谢

该协议主要修改自Hurkman和Tanaka（1986）。我们感谢他们的最初贡献。

参考文献

Hurkman，W.J.and Tanaka，C.K。（1986）。通过二维凝胶电泳分析植物膜蛋白的溶解性。植物生理学 81（3）：802-806
Wang，C.S.，Walling，L.L.，Eckard，K.J.and Lord，E.M。（1992）。 Lilium longiflorum发育的花药中蛋白质积累的模式< em>与组织学事件相关联。 118-127。
Yang，C.Y.，Chen，Y.C.，Jauh，G.Y.and Wang，C.S。（2005）。 Lily ASR蛋白涉及脱落酸信号传导，赋予拟南芥中的抗旱和抗盐性。植物生理学 139（2）：836-846。