材料和试剂

细胞系-L929（ATCC，目录号：CCL-1）
金黄色葡萄球菌菌株Sanger 476（Wellcome Trust Sanger Institute，目录号：MSSA476）
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）（Life Technologies，Gibco ，目录号：11965-092）
L-谷氨酰胺（Life Technologies，Gibco ，目录号：25030-081）
青霉素 - 链霉素（Life Technologies，Gibco ，目录号：15140-148）
胎牛血清（Hyclone，目录号：SH30070.03）
DPBS（Life Technologies，Gibco ，目录号：14190）
EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：E6758）
胰蛋白酶-EDTA（Life Technologies，Gibco ，目录号：25200-056）
ACK裂解缓冲液（Life Technologies，Gibco ，目录号：A10492-01）
组织培养水（Hyclone，目录号：SH3052902）
胰蛋白酶大豆肉汤粉（TSB）（BD，目录号：211768）
碘化己啶（Life Technologies，Invitrogen ^{TM，目录号：H7593）}
FITC-抗小鼠F4/80（BioLegend，目录号：123107）
具有10％FBS（D10）的DMEM完全培养基（参见配方）
L细胞培养基上清液（L-sup）（参见配方）
骨髓巨噬细胞培养基（BMM培养基）（参见配方）
500 mM EDTA（见配方）
5 mM EDTA（见配方）
TSB（参见配方）
碘化己锭（见配方）

设备

26G针（Sigma-Aldrich，目录号：Z192392-100EA）
注射器（Terumo Medical Corporation，目录号：SS-30L）
细胞培养皿（Corning，目录号：430293）
6孔板（Falcon，目录号：351146）
75cm烧瓶（Corning，目录号：430641）
真空过滤系统（Corning，目录号：430758）
50ml康宁管（Corning，目录号：430290）
5ml流式细胞术管（BD，目录号：352054）
细菌孵箱摇床
CO <2>孵化器
Sorvall RT7离心机
流式细胞仪（FACSCanto）

软件

FlowJo

程序

骨髓来源的巨噬细胞（BMDM）的分化
1. 通过CO 2安乐死三只小鼠。用70％乙醇灭菌小鼠的腹部和后腿。
2. 在腹部的中线做一个切口，暴露后脑肢体。删除所有的肌肉从骨头和切骨头在两端。
3. 排出骨髓祖细胞骨头使用DPBS通过注射器用26G针。每次冲洗3-5次骨。在Sorval RT7离心机中旋转细胞（4℃，1,500 rpm，5分钟）。
4. 使用真空吸出上清液后抽吸，通过5ml ACK裂解缓冲液处理细胞以裂解红细胞（1分钟，室温）。
5. 接下来，向裂解的细胞中加入45ml DPBS以平衡渗透压。
6. 再次旋转细胞，通过血细胞计数器计数细胞，并调整它们在BMM培养基中浓度为5×10 5个细胞/ml。种子10ml细胞在每个10-cm组织培养皿中。预期产生1×10 8个骨来自三只小鼠的骨髓细胞
7. 在CO 2培养箱中在37℃下培养细胞3天。然后换新鲜的BMM培养基并培养另外4天（10ml /皿）。
8. 巨噬细胞现在准备用于功能测定。
9. 将盘放入无菌组织培养罩，用5ml冷DPBS洗涤两次。
10. 向每个皿中加入2ml 5mM-EDTA（室温），并等待约5 min以分离细胞。添加5毫升D10每个菜，收获所有的细胞。预期每个培养皿产生〜5 x 10 ⁶个BMDM
11. 使用这个准备，超过95％的分化细胞应该基于F4/80和CD11b表达的巨噬细胞。分析表达式的这些标记物通过常规流式细胞术技术。选择不同染料（例如对于F4/80的FITC和对于CD11b的APC）。
文化。 aureus 指数期间
1. 实验前一天，接种S. aureus 转化为3ml TSB 生物安全柜和细菌在细菌中过夜培养培养摇床（37℃，225rpm）。
  
  aureus 是一种生物安全水平2 病原体，其可以引起严重的人类感染。
2. 接下来早晨，稀释100微升过夜培养到10毫升新的TSB。的近似OD 600大约为0.1。摇动细菌约2 直到OD 600达到约0.8（37℃，225rpm）。 OD 600的1.0 约1.5×10 9 CFU/ml
3. 旋转细菌（4℃，3,000rpm，10分钟），并用50ml冷DPBS洗涤两次
4. 在DPBS中将细菌浓度调节至5×10 8 s/ml。测定前将细菌放在冰上。
Stain 。 aureus 与Hexidium Iodide
1. 等分1ml em。金黄色葡萄球菌（5×10 8 /ml）加入到50ml康宁管中。
2. 加入20μl碘化铱股票并混合好。
3. 在黑暗中（室温）孵育细菌15分钟。
4. 用50ml冷DPBS洗涤两次（4℃，3,000rpm，10分钟）。
5. 重悬细菌在BMM培养基中浓度为2× 10 /ml。细菌准备用于测定。立即使用它们。
巨噬细胞吞噬作用测定
在测定前一天，将2×10 6个BMDM接种到6孔板中的单个孔中。对于S应用感染复数（MOI）10。 aureus 感染。
1. 简而言之，在测定当天，取出旧培养基并更换新的含有S的BMM培养基。 aureus （2×10 7/u/ml）
2. 快速旋转6孔板（室温，500rpm，5分钟）。孵育细胞在CO 2培养箱中30分钟，以允许细菌被BMDMs吸收。
3. 然后加入200μl冷胰蛋白酶-EDTA的细胞并在室温下孵育10分钟，无需搅拌除去巨噬细胞表面的残留细菌。
  注意：胰蛋白酶-EDTA 溶液处理是除去过量的细菌。长期治疗也可能影响BMDM的粘附性，因此处理时间不应超过 10分钟。胰蛋白酶-EDTA处理不会干扰F4/80分析。
4. 用DPBS洗涤板三次，每次洗涤使用2ml DPBS。
5. 加入0.5ml 5mM-EDTA（室温）至孔中以分离细胞在约5分钟，然后2ml D10。通过纺纱收获BMDMs（4 1500rpm，5分钟）。洗涤细胞在50 ml DPBS和重悬细胞 10ml D10。通过血细胞计数器计数细胞。
用FITC-抗小鼠F4/80染色巨噬细胞
1. 将来自程序D的1×10 6个BMDM加入到5ml流式细胞仪管中并旋转在Sorval RT7离心机中（4℃，1,500rpm，5分钟）。吸气上清液。重悬细胞在100微升DPBS。三个附加控制包括一个空白管，用于流式细胞术分析无荧光染料，一次FITC-抗小鼠F4/80单染色管和一个Hexidium Iodide单染色管
2. 加入1μl FITC-抗小鼠F4/80加入到试管中（终浓度：5μg/ml）。并在黑暗中孵化20分钟搅拌（室温）。
3. 然后加入500μlDPBS。细胞准备用于流式细胞术测定。
流式细胞术
常规流式细胞术技术用于根据制造商的说明进行的吞噬分析。在FACSCanto机器中，从碘化己啶染色产生的荧光落入FL2通道（激发488/Emmision 575），从FITC染色产生的荧光落入FL1通道（激发488/Emmision 519）。结果可以由FlowJo分析。表演者应该熟悉FlowJo软件来分析4色流细胞计数数据。简而言之，在FlowJo软件中打开流式细胞术数据。首先，在X轴和Y轴上绘制FSC和SSC。然后门单个活细胞。最后在单个活细胞的X轴和Y轴上绘制FITC和PE

图1.骨髓来源的巨噬细胞（BMDM）吞噬实验的实例。空白：没有FITC-抗F4/80染色和细菌摄取的BMDM。 FITC：具有FITC-抗F4/80染色但无细菌摄取的BMDM。碘化己啶：具有细菌摄取但没有FITC-抗F4/80染色的BMDM。 BMDM-吞噬作用：具有FITC-抗F4/80染色和细菌摄取的BMDM。

食谱

含有10％FBS（D10）的DMEM完全培养基 440 ml DMEM
50ml FBS
5ml L-谷氨酰胺（储存浓度：200mM） 5ml青霉素 - 链霉素（储存浓度：10,000U/ml）储存在4°C
L细胞培养基上清液（L-sup）
种子在75ml烧瓶中的5×10 5 L-929细胞在55ml D10中将细胞培养一周以上
收获培养基并通过真空过滤系统过滤，冷冻并储存在-20℃下，并在6个月内使用它们。
BMM介质
350 ml D10
150 ml L-sup
储存在4°C
500 mM -EDTA
将146g EDTA溶于组织培养水中，将pH调节至8.0
5mM-EDTA 5ml 500mM-EDTA
495ml DPBS
储存在4°C
TSB
将30g胰蛋白酶大豆肉汤粉末溶解在去离子水中，在121℃高压灭菌30分钟
在室温下贮存
碘化己锭（5mg/ml）
将5mg碘化己啶溶解在1ml DMSO中，溶于黑暗中
等分并储存在-20°C

致谢

这项工作由NIH R01-AI068804支持。 Fowler博士受到中等职业指导奖K24-AI093969的支持。金黄色葡萄球菌的荧光染色从Mason等人（1998）改编，并且骨髓来源的巨噬细胞的分化改编自Weischenfeldt和Porse（2008）。

参考文献

Mason，D.J.，Shanmuganathan，S.，Mortimer，F.C.and Gant，V.A。（1998）。用于流式细胞术和落射荧光显微镜的荧光革兰氏染色。 Appl Environ Microbiol 64（7）：2681-2685。
Weischenfeldt，J。和Porse，B。（2008）。骨髓来源的巨噬细胞（BMM）：隔离和应用。 Protoc 2008：pdb prot5080。
Yan，Q.，Sharma-Kuinkel，BK，Deshmukh，H.，Tsalik，EL，Cyr，DD，Lucas，J.，Woods，CW，Scott，WK，Sempowski，GD，Thaden， Ahn，SH和Fowler，VG，Jr。（2014）。 Dusp3和Psme3与对金黄色葡萄球菌感染和人类的小鼠易感性有关败血症。 PLoS Pathog 10（6）：e1004149。