材料和试剂

设备

程序

生物膜生长分析
1. 将一块枯草芽孢杆菌实验室菌株168（从-80℃）接种到BHI琼脂平板上过夜（〜18小时），37℃。
2. 从过夜的琼脂平板（一个菌落）接种5ml BHI培养液，并在37℃下摇动（〜200rpm）生长4小时。
3. 将培养液培养物（12μl）接种到培养皿中的12ml MSGI培养基中
4. 让生物膜在37℃孵育（盖上盖子而不摇动）（通常为3天和7天）。确保孵化器有一个水箱，以确保菜肴不会干燥。
从生物膜净化囊泡
1. 在所需时间后，从板上取出防护薄膜组件和上清液通过在4℃下以15,000×g移液和离心20分钟以除去细胞和大碎片
2. 为了去除剩余的细胞和碎屑，用0.22微米注射器过滤器过滤上清液。
3. 离心过滤，用离心过滤器单元的无细胞上清液浓缩至小于3ml体积
4. 从上清液中沉淀小泡，将超速离心机浓缩上清液在195,000 x g下在4℃下在聚集管中进行1小时
5. 去除上清液，不要通过移液来干扰囊泡
6. 在500μlPBS中洗涤后重复旋转。
7. 从管中取出PBS洗涤，不会干扰囊泡颗粒
8. 将沉淀重悬于所需体积的PBS中。

笔记

枯草芽孢杆菌在培养基表面生长成生物膜（图1）。它可能需要少量洗涤以去除所有细胞进行囊泡收集。图2显示了阴性染色小泡的电子显微照片
生物膜可以生长在各种平板上以达到所需体积的囊泡。理想情况下，您想要在超速离心后具有可见的颗粒。如果没有颗粒可见，请放大板的大小或生物膜的数量以进行囊泡净化。
超速离心后的囊泡应该是可见的，但是在培养体积小的情况下，颗粒可能很难看清。

图1.六孔板中的生物膜防护薄膜的表征

图2.从枯草芽孢杆菌生物膜分离的囊泡的阴性染色TEM。比例尺= 100 nm

食谱

1×磷酸缓冲盐水（PBS）（1L，pH7.4）（过滤或灭菌高压灭菌） 137 mM NaCl
2.7 mM KCl
10mM Na 2 HPO 4
1.8mM KH PO 4
用盐酸调至pH 7.4 溶解于H 2 O，最高达1L
MSgg培养基（pH7）（过滤消毒）
50μMMnCl 2
5mM KH 2 PO 4
1μMZnCl 2
50μMFeCl 3
2mM MgCl 2
700μMCaCl 2
50μg/ml苏氨酸，色氨酸和苯丙氨酸 0.5％谷氨酸盐
0.5％甘油
2微米硫胺素
100mM吗啉丙磺酸（MOPS）（pH7）

致谢

来自NIH的拨款编号：HL059842，AI033774，AI033142，AI052733和艾伯特爱因斯坦医学院艾滋病研究中心。
协议是从Brown等人改编而来的。（2014）和McLoon等人。（2011）。

参考文献

Brown，L.，Kessler，A.，Cabezas-Sanchez，P.，Luque-Garcia，J.L。和Casadevall，A。（2014）。由革兰氏阳性细菌枯草芽孢杆菌产生的细胞外囊泡被脂多糖表面活性素.Mol Microbiol 93（1）：183-198。
Prados-Rosales，R.，Brown，L.，Casadevall，A.，Montalvo-Quirós，S.and Luque-Garcia，J.L。（2014）。在革兰氏阳性菌和分枝杆菌中分离和鉴定膜囊泡相关蛋白。方法X 1：124-129。
McLoon，A.L.，Guttenplan，S.B.，Kearns，D.B.，Kolter，R。和Losick，R。（2011）。追踪生物膜形成细菌的驯化。细菌学/em> 193（8）：2027-2034。