材料和试剂

30日龄的水稻根或芽
液氮
3 M乙酸钠（Thermo Fisher Scientific，目录号：S209-500）
氯霉素（50mg/ml）（Sigma-Aldrich，目录号：C0378）
在MilliQ水中的环己酰亚胺（50mg/ml）（Sigma-Aldrich，目录号：C7698）
注意：环己酰亚胺通过阻断翻译延伸来抑制蛋白质合成。该分子干扰tRNA与mRNA和核糖体的移位，导致mRNA上的固定核糖体。
8M盐酸胍溶液（Sigma-Aldrich，目录号：G9284）
氯仿
乙二醇 - 双（2-氨基乙醚）-N，N，N'，N' - 四乙酸（EGTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E3889）
异丙醇
KCl（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP-366-500）
线性丙烯酰胺（5mg/ml）（Life Technologies，Invitrogen ^{TM，目录号：AM9520）}
MgCl 2（Sigma-Aldrich，目录号：M-2393）
Nonidet P40（Biocompare，目录号：DG514）
苯酚水饱和
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：S1888）
Tris缓冲液（pH8.4）（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP152-1）
Trizol试剂（Life Technologies，Invitrogen ^{TM，目录号：15596-026）}
10x蔗糖溶液盐缓冲液（见配方）
2 M蔗糖（见配方）
20-50％蔗糖溶液（见配方）
聚合物缓冲液（参见配方）

设备

0.22μm过滤器
由
组成的密度梯度分馏系统
1. 蠕动泵（Gilson Minipuls 3蠕动泵）
2. Cary 60紫外 - 可见分光光度计（Agilent）
3. 流动池石英（1mm113μl，1/pk）（Agilent，目录号：6610019900）
4. 馏分收集器（Bio-Rad Laboratories，型号：2110）
Beckman optima L-70超速离心机（Beckman Coulter）
Beckman管
parafilm
Boekel科学轨道旋转器I（115V）（Boekel Scientific）
Mini离心机（Eppendorf，型号：5415D）
NanoDrop（Thermo Fisher Scientific）

软件

Agilent Cary WinUV软件

程序

蔗糖梯度的制备
1. 通过混合36.7ml蔗糖制备50ml 50％（w/v）蔗糖溶液（2M）和13.3ml 10x蔗糖盐。 0.22μm过滤器过滤器
2. 通过混合制备50ml的35％（w/v）蔗糖溶液 25.6ml蔗糖（2M）和24.4ml 10x蔗糖盐。过滤具有0.22μm过滤器的溶液
3. 制备62ml的20％（w/v）蔗糖溶液，通过混合18.2ml蔗糖（2M）和43.8ml 10x蔗糖盐。用0.22μm过滤器过滤溶液。
4. 对于一个梯度，小心地加入1.85ml的50％蔗糖溶液，3.65ml的35％ 3.65ml的20％（w/v）和再次1.35ml的20％（w/v）的Beckman管（12ml总体积）。至少在细胞前一天准备梯度裂解使梯度在4℃下扩散过夜
5. 封面用石蜡膜封闭，并在4℃下孵育过夜。或者，蔗糖梯度可以无限期储存在-80℃
  
  图1。蔗糖梯度。蔗糖层的分布（蔗糖浓度显示为右侧的每体积重量百分比）。
隔离和多核糖体分析
1. 收获30日龄的稻根或芽，冷冻并在液氮中研磨成粉末
2. 将150mg粉末与1.2ml冷冻多核糖体缓冲液混合。
3. 通过在4℃下以16,000×g离心15分钟除去碎片。
4. 转移所得上清液的等分试样（约500μl） μl）至新的预冷的1.5ml管中。对于每个样品测量OD 260nm 使用NanoDrop。
5. 加载相同OD量的裂解物到每个梯度至20至50％（w/w）连续蔗糖梯度。保持10％裂解物作为输入以确定胞质稳态mRNA 级别。
6. 在超速离心之前，每个梯度重量和平衡
7. 在4℃下使用SW41Ti转子在Beckman Coulter中以175,000×g离心165分钟。
8. 当样品离心时，用部分收集器清洗温的MilliQ水，含有一点RNase净化溶液
9. 小心地从转子上取下管子，并将其放置在4°C，直到它们准备好运行
10. 打开计算机，泵，UV-Vis分光光度计和分数集电极。按2.3 ml/min设置泵，按时间设置馏分收集器。将10ml管置于馏分收集器上。
11. 打开Cary WinUV软件。
12. 从梯度的底部到顶部收集级分连续监测254nm处的吸光度。运行追逐溶液[20％（w/v）蔗糖]与溴酚蓝反应直到它到达针。确保看到至少一滴下降离开针头，使得没有气泡被引入到梯度中
13. 开始通过梯度运行追逐解决方案。使用泵以2.3ml/min运行溶液
14. 点击获取数据按钮，并在馏分收集器上运行
15. 将馏分置于干冰上。
多聚体RNA提取
1. 向每个管中加入4 ml Trizol试剂
2. 根据制造商的Trizol方案分离RNA
3. 测量每个馏分或输入的RNA浓度。

代表数据

我们使用一种简单和高度可重复的方法来分析水稻中的多核糖体（ Oryza sativa ）。我们做的所有实验，显示非常相似的配置文件，但是，当植物压力和老植物时，可以观察到轮廓的形式的一些差异。在文献中，来自不同植物物种的多核糖体谱的分析显示物种和植物器官之间的变异性，如下面的图2所示。

图2.来自不同植物物种的多核糖体谱的分析

实施例1（图2a）：来自Medic藜苜蓿根的多粒体诱发。通过1.7-m蔗糖垫超速离心转基因根的全部提取物（S-16）以获得核糖体上清液（S-170）和核糖体沉淀物（P-170），使核糖体沉淀。通过20-60％（w/v）蔗糖密度梯度超速离心分离P-170，记录254nm处的吸光度。显示了单体（<80mS）和大多核糖体（LP，≥5个核糖体）的位置。 [来自Reynoso 等人。（2012）]
实施例2（图2b-c）：通过常规超速离心（P-170）（a）或通过免疫纯化（洗脱液）（b）从天冬瓜拟南芥叶组织中纯化的核糖体在20％至60记录％（w/v）蔗糖密度梯度和UV吸光度（254nm）分布。显示了60S核糖体亚基，80S单体和多核糖体的位置。 [来自Zanetti 等人。（2005）]
实施例3（图2d）：镉诱导的使用拟南芥悬浮细胞的多核糖体谱的改变。用200μM镉处理4或12小时的对照和镉处理的细胞的多核糖体谱。 [from Sormani et al 。（2011）]
实施例4（图2e）：来自豌豆的核糖体和多核糖体的蔗糖密度图。 6小时后回收核糖体。通过1M蔗糖垫离心。 E254 =在254nm处的吸光度 [来自Leaver和Dyer（1974）]
实施例5（图2f-g）：分别从烟草叶组织和原生质体获得的典型多核糖体谱显示在（a）中。分离对烟草叶的多核糖体群的影响显示为un（b）。从附着叶（左）获得的多核糖体制剂的蔗糖密度梯度曲线，叶分离并漂浮在水上4小时（中间），叶子分离并漂浮在0.6M甘露醇上4小时（右）。 [来自Ruzicska ]。（1979）]
实施例6（图2h）：从在充足的培养基（15天龄）中生长的幼小WT水稻植物的根产生的聚合体轮廓。 [来自Jabnoune（未发表）]

图3.多核糖梯度的分馏

图4.获取的数据的代表示例

注意：我们使用一种简单和高度可重复的方法来分析水稻（Oryza sativa）中的多核糖体。我们做的所有实验，显示非常相似的配置文件，但是，当植物压力和老植物时，可以观察到轮廓的形式的一些差异。在文献中，来自不同植物物种的多核糖体谱的分析显示物种和植物器官之间的变异性（参见图2中的实例）。

笔记

为了从蔗糖密度离心中分离RNA形式级分用于多核糖体分析，重要的是要记住，在大规模提取的情况下（稻产生比Arabidospis更多的生物材料），TRizol纯化可以是最佳选择。在小样品（特别是拟南芥根样品）的情况下，使用RNeasy试剂盒纯化RNA将更具成本效益，但有时RNA的质量对于随后的qPCR分析将不是高质量的。重要的是，以12,000×g离心Trizol提取物15分钟以分离各相。我们必须在中间相处牺牲一层水相（含有RNA），以便我们将蛋白质和苯酚带到RNA。

食谱

10x蔗糖溶液盐缓冲液（100ml） 0.4M Tris-HCl（pH 8.4）
0.2 M KCl
0.1M MgCl 2
qsq 100 ml H 2 O v/v 高压灭菌器
高压灭菌后加入
100μg/ml放线菌酮
1x蛋白酶抑制剂混合物（无EDTA）
100单位/ml RNase抑制剂
2M蔗糖（200ml）蔗糖137g
Qsq 200ml 1x蔗糖溶液盐
高压灭菌器

20-50％蔗糖溶液

最终（％）	体积（ml）	蔗糖2μM/	1x蔗糖盐
50％	12	8.8	3.2
	25	18.3	6.7
	50	36.7	13.3
	75	55	20
35％	25	12.9	12.1
	45	23.1	21.9
	50	25.6	24.4
	90	46.3	43.7
	100	51.3	48.7
	150	76.9	73.1
20％	32	9.4	22.6
	62	18.2	43.8
	122	35.8 /	86.2
	200	58.6	141.4

聚合体缓冲液（10ml）
10x蔗糖溶液盐2.5ml
EGTA 20mg
Nonidet-P40 50微升
环己酰亚胺（50mg/ml）10μl
氯霉素（50mg/ml）10μl
Qsq 10ml H 2 O *

致谢

这项工作由瑞士国家基金会拨款（31003A-12293和31003A-138339）和中瑞科学技术合作计划（IZLCZ3 123946到YP和2009DFA32040到QS）资助。

参考文献

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Lanet，E.，Delannoy，E.，Sormani，R.，Floris，M.，Brodersen，P.，Crete，P.，Voinnet，O.and Robaglia，拟南芥微RNA的翻译抑制的生物化学证据。 em> Plant Cell 21（6）：1762-1768
Leaver，C.J。和Dyer，J.A。（1974）。注意植物核糖体研究的解释 Biochem J 144（1）：165-167。
Reynoso，M.A.，Blanco，F.A.，Bailey-Serres，J.，Crespi，M。和Zanetti，M.E。选择性地将mRNA和miRNA选择性地募集到多核糖体中以响应根瘤菌感染在Medic藜苜蓿 73：289-301。
Ruzicska，P.，Mettrie，R.，Dorokhov，Y.L.，Premecz，G.，Olah，T.and Farkas，G.L。（1979）。从烟草叶中分离的原生质体中的聚核糖体。 145 （2）：199-203
Sormani，R.，Delannoy，E.，Lageix，S.，Bitton，F.，Lanet，E.，Saez-Vasquez，J.，Deragon，J.M.，Renou，J.P.and Robaglia，拟南芥亚致死性镉中毒在多个层面影响翻译。植物细胞Physiol 52（2）：436-447
Zanetti，M.E.，Chang，I.F.，Gong，F.，Galbraith，D.W。和Bailey-Serres，J。（2005）。拟南芥的多核糖体复合物的免疫纯化用于基因表达的全局分析植物 Physiol 138（2）：624-635。