Materials and Reagents

Transgenic tomato or tobacco pollen expressing roGFP1 under the control of the pollen-specific promoter LAT52
40% polyethylene glycol (molecular weight 4,000) (Sigma-Aldrich, catalog number: 81242)
Pollen germination medium (see Recipes)

Equipment

Biovortexer（Bio Spec Products，目录号：1083）
轨道振动器（Kylin-Bell Lab Instruments，型号：TS-2）
6或24孔细胞培养板
显微镜载玻片和盖玻片
共聚焦显微镜（OLYMPUS，型号：FV1000）或配备有405nm和488nm激光线的其它显微镜

软件

Olympus Fluoview 3.0a版
注意：ImageJ（版本1.49 g，Rasband，NIH，USA）也可用于测量共焦图像的强度。

程序

该方法包括收获花粉颗粒，将其孵育在液体萌发培养基中，进行活细胞成像和进行比率分析。花粉将在约30分钟开始发芽。然后进行使用共焦显微镜的比率成像。这可以在几分钟内完成。可以在稍后的时间点进行比例图像分析。

体外花粉管发芽
1. 通过振动获得2-10mg成熟的番茄或烟草花粉花药开放的花与生物漩涡约每秒5秒（图1A-C）。
  注意：植物生长条件影响花粉质量，特别是番茄。例如，适当的温度和足够的阳光是适当花粉所需的重要因素发展。此外，感染病原体通常导致差花粉产量和质量。一般来说，新开的花含有更具活力的花粉。
2. 用花粉稀释花粉花粉萌发培养基至终浓度为0.5-2mg/ml。转移到6或24孔细胞培养板，并在25-28孵育 ℃。番茄和烟草花粉被旋转分别在60和140rpm水平（图1D）。花粉颗粒立即水化并在孵育后约30分钟时发芽。它建议在8小时内观察花粉管保持正常生长注意：温度对于体外是至关重要的花粉管生长并对氧化还原电位具有不可忽略的影响生长花粉管。保持花粉培养基在a 实验过程中的恒温。
  
  图1.花粉收集和液体发芽测定。 A.生物振动器的图像。公元前。通过振动收集烟草（B）或番茄（C）的成熟花粉使用生物涡旋。 D.将萌发培养基中的花粉转移至 6孔培养板（〜2ml /孔）或24孔培养板（0.5ml） ml /孔）并在固定室的轨道振荡器上发芽温度。

显微镜设置
Olympus FV1000的详细参数如下所示。其他仪器需要设置为类似的参数。

选择"多轨模式"。在轨道1中，激发波长为 405nm。在轨道2中，激发波长为488nm。排放两个轨道用505-530nm的带通滤波器收集。一个可以在轨道1或者轨道1中同步收集透射图像轨道2.

设置选项。

扫描模式	XY
扫描方向	一种方法
图片大小	800 * 800
位/像素	12位
采样速度	4.0μs/像素
C. A.	80-120μm
集成类型	卡尔曼线
整合计数	4

注意：应以行模式拍摄图像以确保正确比率分析（Meyer和Brach，2009）。其他设置，包括激光功率，增益设置，采样速度，针孔尺寸（C.A.）积分计数，可以根据经验进行优化，但只有拍摄的图像与相同的设置进行比较。在我们的研究中，获取了图像与20x镜头（UPLSAPO; NA0.75），位深度为212.校准的roGFP可以确定氧化还原的绝对值潜力和看到氧化还原依赖性变化动力学。虽然我们没有尝试校准roGFP强度在黄等人（2014），读者可以参考Meyer和Brach（2009）。

氧化还原敏感GFP成像
1. 水合花粉粒或生长花粉管可以容易地用共聚焦显微镜成像。
  注意：细胞氧化还原状态在发芽花粉或生长花粉中在不同时间点的管是高度动态的。重要的是在短时间内比较两个连续样本（即， 0.5小时内）。
2. 在显微镜载玻片上加入约40μl样品，用盖玻片轻轻盖上样品，放置约2分钟。
3. 将幻灯片放在显微镜上。使用"快速"扫描轨道来调整激光强度和增益设置表达花粉管。避免图像太暗或曝光过度。不要更改激光强度和增益设置他们是确定的。
4. 开始收集图像。
图像处理和比率分析
1. 使用Olympus Fluoview 3.0a版打开组合图像。
2. 单击"比率/浓度"工具。设置适当的比率范围和将405nm激发图像（图2B）除以488激发图像（图2C）。结果图像（12比特）和颜色条如图1D所示
3. 选择"Hi-Lo" 伪彩色方案用于查找表中的405和488通道（LUT设置）。在此配色方案中，昏暗像素显示为蓝色（图2I，ROI3），而过度曝光的像素显示为红色（图 2G，ROI2）。
4. 绘制比例图的感兴趣区域（ROI）使用ROI工具栏进行分析。避免太暗的区域（ROI3 in 图2I）或曝光过度（图2G中的ROI2）
5. 选择 "强度剖面"工具并测量ROI1的信号强度 405和488通道。将强度信息保存到Excel 文件。
6. 屏蔽掉低信号强度的像素[阈值 100在Huang等人（2014）中使用]，然后计算平均值每个通道的强度。统计分析的最终比率为通过将405通道的平均强度除以488的平均强度获得渠道。
  
  图2. roGFP1的氧化还原依赖性荧光代表性的番茄花粉管的胞质溶胶。 A.明亮的场。 B.的 405nm激发后505-530nm发射信号。 C. 505-530nm 发射信号后488 nm激发。 D. roGFP1的405/488比例荧光。插图显示了比值的色标。 E. 明场图像上的三个ROI（感兴趣区域）。 F-I。以绿色F-H或"Hi-Lo"方案伪色的荧光图像 G-I。 Bar =10μm

食谱

花粉萌发培养基
花粉萌发培养基应每次从下面列出的储备溶液中新鲜制备。所有储备溶液可以高压灭菌并在4℃下储存约半年。在使用之前，让发芽培养基升温至室温是很重要的

库存解决方案	对于14ml PGM	最终浓度
40％聚乙二醇	8.4 ml	24％（w/v）
50％蔗糖	700微升	2.5％（w/v）
1 M MES-KOH（PH 6.0）	280μl	20 mM
1％硼酸	140微升	1.6 mM
2％MgSO 4。 7H 2 O	140微升	0.8 mM
1％KCl	140微升	1.3 mM
1 M Ca（NO 3）sub 2	42微升	3 mM
H sub 2 O	4.2 ml	-

致谢

roGFP1由James Remington博士友情提供。这项工作得到了中国自然科学基金会（东张，批准号：30970266，中国科学技术部批准号：31170291）和中国科学技术部（Grant 2012AA10A302-W.H.T.）的支持。我们感谢小舒高帮助roGFP成像和李玉杰拍照。

参考文献

Hanson，G.T.，Aggeler，R.，Oglesbee，D.，Cannon，M.，Capaldi，R.A.，Tsien，R.Y。和Remington，S.J。（2004）。使用氧化还原敏感的绿色荧光蛋白指示剂研究线粒体氧化还原电位。 Biol Chem 279（13）：13044-13053
Huang，W. J.，Liu，H. K.，McCormick，S.and Tang，W. H.（2014）。番茄雌蕊因子STIG1通过与磷脂酰肌醇结合促进体内花粉管生长3-磷酸和花粉受体激酶LePRK2的胞外结构域。植物细胞26（6）：2505-2523。
Meyer，A.J。和Brach，T。（2009）。通过共聚焦激光扫描显微镜在植物中通过氧化还原敏感性GFP进行动态氧化还原测量。 em> Methods Mol Biol 479：93-107。