材料和试剂

小鼠（Jackson Laboratories，C57Bl/6）
2,2,2-三溴乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：T48402）
2-甲基-2-丁醇（Sigma-Aldrich，目录号：240486）
PBS（Gibco，目录号：10010-015）
0.5 M EDTA（Lonza，目录号：51234）
2-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号M3148）
BSA（Amresco，目录号：0332-500g）
HBSS（Life Technologies，目录号：24020-091）
RPMI 1640 GlutaMax（Life Technologies，目录号：61870-010）
庆大霉素（Gibco，目录号：15710-049）
胎牛血清（FBS）（Sigma-Aldrich，目录号：F7524）
Liberase TM（Roche Diagnostics，目录号：05401127001）（在50ml RPMI中稀释50mg，等分并保存在-20℃）
DNase I（Roche，目录号：04536282001）（在1ml PBS中稀释的内含物，等分并保存在-20℃）
FACS抗体
1. CD3-FITC（eBioscience，克隆145-2C11，稀释1/300）
2. CD19-FITC（eBioscience，克隆1D3，稀释1/500）
3. CD11c-PE-eFluor610（eBioscience，N418，稀释1/300）
4. MHCII-APC-Cy7（Biolegend，克隆M5/114.15.2，稀释1/1000）
5. CD8a-PE-Cy5（BD-Pharmingen，克隆53-6.7，稀释度1/600）
6. CD11b-PE-Cy7（BD-Pharmingen，克隆M1/70，稀释1/800）
7. CD64-AF647（BD-Pharmingen，克隆X54-5/7.1，稀释1/100）
8. CD16/CD32（内部生产，克隆2.4G2，稀释1/200）
  注意：使用2.4G2通过抑制使背景荧光最小化抗体对存在于免疫上的FcG-受体的非特异性结合细胞。
可固定活性染料eFluor 506（eBioscience，目录号：65-0866-18）
1. 用400μlPBS重构小瓶
2. 将样品瓶和存储瓶置于-80°C
3. 稀释度为1/200时使用
抗FITC微珠（Miltenyi，目录号130-048-701）
LD柱（Miltenyi，目录号：130-042-901）
Ultra Comp eBeads（eBioscience，目录号：01-2222-42）
台盼蓝（Sigma-Aldrich，目录号：T8154）
Avertin（参见食谱）
2x消化培养基（参见配方）
MACS缓冲区（参见配方）
R10介质（见配方）
渗透裂解缓冲液（参见配方）

设备

100μm尼龙细胞过滤器（Falcon，目录号：352360）
15ml管（Falcon，目录号：430791）
35 mm培养皿
5ml注射器（Norm-Ject，目录号：4020-000V0）
25号针（Terumo，目录号：NN-2516R）
巴斯德移液器
镊子
外科剪刀/手术刀
37°C温水浴
振动器
离心机
抽吸装置
MACS MultiStand（Miltenyi，目录号：130-042-303）
Midi MACS（Miltenyi，目录号：130-042-302）
具有100μm细胞过滤帽的聚苯乙烯5ml管（BD Falcon，目录号：352235）
聚丙烯5ml管（BD Falcon，目录号：352063）
显微镜
Bürker-Türk计数板
多色FACS分选机（BD Aria II或配备405 nm，488 nm和633 nm激光器及相应滤光片组的等效细胞分选机）

程序

安乐死小鼠腹腔注射0.5毫升的avertin用25号针。小鼠在1-2分钟后变得无反应。
注意：如果其他安乐死方法到位，请验证机构批准的动物福利道德规范。
通过用镊子夹住后肢的爪子来检查脑脊髓反射的缺失。
用70％乙醇喷洒动物后，打开右胁腹并取出脾脏。取出与脾相连的任何脂肪组织，并将器官置于含有5ml冰冷HBSS的15ml管中。
将脾脏置于35mm培养皿中，使用剪刀将器官切碎。为了获得良好的组织离解，继续直到用裸眼看不到任何碎片
加入1ml冰冷的RPMI，将细胞悬浮液置于15ml Falcon管中并置于冰上。在添加消化培养基之前完成所有其他器官。
向细胞悬浮液中加入1ml 37℃预热的2x消化培养基，并将所有器官置于37℃温水浴中。确保振动筛处于最大设置。
注意：摇动样品会减少其沉淀，从而更有效地消化组织。
孵育细胞悬液15分钟，通过巴氏吸管向上和向下吸移溶液解离细胞悬液。
重复步骤7一次。
加入10毫升冰冷的MACS缓冲液，并在4℃下以400×g离心细胞悬浮液4分钟。
吸出上清液，并在2ml冰冷的渗透裂解缓冲液中重悬细胞沉淀。在室温下孵育4'，随后加入10ml冰冷的MACS缓冲液。在4℃下以400×g离心细胞悬浮液7分钟
重悬细胞在10毫升冰冷的MACS缓冲液，通过一个100微米的细胞过滤器过滤。可以重复使用15ml管收集过滤的细胞。取一个20微升的计数样品，并在4℃，7分钟，4℃下旋转细胞悬浮液的剩余部分。
加入180微升台盼蓝到20微升的计数样品，混匀。计数单元格。消化后，1个脾通常含有高达60-100×10 6个细胞。
从细胞沉淀中取出上清液，并以每1ml混合物（见表1）50×10 6个细胞的浓度重悬于抗体混合物I中。在冰上在黑暗中染色20分钟。加入10毫升冰冷的MACS缓冲液，并在4分钟内400转/分4℃下旋转。

表1. MACS缓冲液中的抗体混合物

标签
标记
克隆
稀释

FITC
CD3
145-2C11
1/300

FITC
CD19
1D3
1/500

-
CD16/CD32
2.4G2
1/200
从细胞沉淀中取出上清液，每10×10 6个细胞加入90μl冰冷的MACS缓冲液。
加入5-10μl/10×10 6个抗-FITC微珠的细胞。重悬并在冰上孵育15分钟。加入10ml冰冷的MACS缓冲液，并旋转7分钟400×g 4℃。弃去上清液。
根据制造商的协议准备LD柱
制备后，将15ml管置于LD柱下的冰上
重悬细胞沉淀在1毫升冰冷的MACS缓冲液和过滤通过100μm柱细胞过滤器在LD柱。
注意：这最小化细胞凝块阻塞LD柱的概率。在1ml细胞悬浮液通过后，用2ml冰冷的MACS缓冲液洗涤2次。确保细胞悬浮液每次通过。弃去柱子并离心流出液（7分钟400×g/4℃）。吸出上清液。

染色细胞沉淀在500μl的抗体混合物II。在冰上在黑暗中染色20分钟。加入10ml冰冷的MACS缓冲液，并旋转7分钟400×g 4℃。吸出上清液并重悬于1ml冰冷的MACS缓冲液中。将细胞悬液加入到带有细胞过滤帽的5ml聚苯乙烯管中，以除去可能的凝块
表2. PBS中的抗体mix II

标签	标记	克隆	稀释
FITC	CD3	145-2C11	1/300
FITC	CD19	1D3	1/500
PE-eFluor610	CD11c	N418	1/300
PE-Cy5	CD8a	57-6.7	1/600
PE-Cy7	CD11b	M1/70	1/800
AF-647	CD64	X54-5/7.1	1/100
APC-Cy7	MHCII	M5/114.15.2	1/1,000
eFluor	506	生存力	1/200
-	CD16/CD32	2.4G2	1/200

注意：使用PBS对于用可固定生存力染料eFluor 506最佳染色死细胞是必要的。

通过在2ml PBS中稀释1滴Ultra comp eBeads制备单染色剂。确保在使用前彻底摇动珠子，作为沉淀发生。将200μl的该珠悬浮液加入到7个5ml反应管（6个荧光染料+ 1个未染色的样品）中。与亮荧光团（PE-eFluor610，Pe-Cy5，AF-647）缀合的抗体稀释1/2000，其他抗体稀释1/400。在冰上在黑暗中染色15分钟。加入1ml PBS，并旋转7分钟400×g <4℃。除去上清液，并重悬在200微升PBS的珠子。进入细胞分选器。
注意：活力染料不与Ultra comp eBeads结合。由于我们排除了死亡细胞（由eFluor 506的阳性染色定义），因此不需要补偿该荧光染料。如果优选补偿，可以用PBS中的eFluor 506活力染料的1/200稀释液对细胞染色。在冰上在黑暗中染色20分钟。用1ml PBS洗涤细胞，并旋转7分钟400×g 4℃。将细胞重悬于200μlPBS中。
门控设置的示例如下所示。

图1.脾脏DC的门控策略。FSC-H/FSC-A图中的严格门控策略允许排除双峰。 CD11b ⁺ DCs（Lin ^{- > CD11c ⁺ MHCII ⁺ CD11b ⁺细胞）包含一部分单核细胞衍生的细胞（具有病原体或炎症的特异性感染可以显着增加这种细胞群体，污染CD11b +细胞）。可以通过排除CD64 ⁺细胞来鉴定常规的CD11b ⁺ DC。}

笔记

人们应该记住尽可能快的工作。一旦从活的动物脾脏DC亚组中移除，则活力快速受损。此外，使用冷试剂改善总生存期
通过使用剪刀和巴斯德移液管的组织的良好解离和脾细胞在消化培养基中的充分温育对于最佳细胞回收是至关重要的。当调整抗体混合物时，请记住，酶消化可能会切割在感兴趣的细胞类型上表达的表面蛋白。
在最佳条件下，使用MACS珠的负选择除去90-95％的CD3e +和CD19 +细胞。这将细胞数目减少到大约5-10×10 6个细胞，总排序时间约为20分钟。
可以从1个脾（在内环境条件下）分选80,000-120,000个CD8a ⁺ DC和400,000-600,000个CD11b ⁺ CD11b ⁺ DC可以通过使用表面标记ESAM或CD4进一步细分。
在要培养细胞的情况下，科学家应该记住从获得脾脏的时刻开始工作不育（步骤4）。使用前，可以使用0.2μm过滤器过滤缓冲液以去除潜在的病原体
可以在加入250ng/ml重组鼠Flt3L的R10培养基中培养细胞。没有任何进一步的刺激; 这些树突状细胞亚群的存活率在培养24小时后小于60％

食谱

Avertin（40 ml）
将1克2,2,2-三溴乙醇溶于1毫升2-甲基-2-丁醇中重悬于39ml PBS中，在室温下振荡过夜避免直接暴露于光，并在4°C下存储
2x消化培养基
用以下命令重建RPMI 1640：
1/500 DNAse I（10IU/ml） 1/25释放酶TM（0.42Wünsch单位/ml）
MACS缓冲区
1x PBS
2％FCS（或2％BSA） 5 mM EDTA
注意：这通过螯合Ca ^{2 +} 最小化细胞对塑料的粘附。在0.2μm过滤器上过滤除菌，并在4℃下保存
R10介质
用以下物质重建RPMI1640-Glutamax：
10％FBS
50μg/ml庆大霉素 50μMβ-巯基乙醇
渗透裂解缓冲液（总共500ml）
450ml MilliQ水（或其它来源的超纯的ddH 2 O） 4.145g氯化铵
100μl500mM EDTA
将pH调节至7.1-7.4
加入MilliQ水至500 ml
在0.2μm过滤器上过滤灭菌并在4℃下贮存

致谢

这项工作得到了欧洲研究委员会，欧盟第七框架计划，Fonds Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen计划（FWO）和Agentschap voor Innovatie door Wetenschap en Technologie（IWT）的支持。

参考文献

Merad，M.，Sathe，P.，Helft，J.，Miller，J.and Mortha，A。（2013）。树突状细胞谱系：树突状细胞及其子集在稳态和发炎的个体发育和功能 Annu Rev Immunol 31：563-604。
Mebius，R.E.and Kraal，G。（2005）。脾的结构和功能。 Nat Rev Immunol 5（8）：606-616。
Osorio，F.，Tavernier，SJ，Hoffmann，E.，Saeys，Y.，Martens，L.，Vetters，J.，Delrue，I.，De Rycke，R.，Parthoens，E.，Pouliot， Iwawaki，T.，Janssens，S.and Lambrecht，BN（2014）。展开的蛋白反应传感器IRE-1alpha调节CD8alpha的功能^{+ < sup> dendritic cells。 Nat Immunol 15（3）：248-257。}