材料和试剂

柑橘类水果组织（地面冷冻的黄油或纸浆组织）
偏磷酸（MPA）（65％）（Sigma-Adrich，目录号：79615）
正磷酸（Sigma-Adrich，目录号：W290017）
Tris碱（Sigma-Adrich，目录号：T1503）
甲醇HPLC级（Sigma-Adrich，目录号：34860）
抗坏血酸（Sigma-Adrich，目录号：A902902）
C18 Sep Pak（Waters，目录号：WAT091139）
DTT（Sigma-Aldrich，目录号：D0632）
无菌Mili-Q水
0.1％MPA（参见配方）
2％MPA（参见配方）
8.5％正磷酸（见配方）
400 mM Tris碱（见配方）
200mM DTT在400mM Tris碱（见Recipes）中
甲醇：Milli-Q水（15:85，v/v）（参见配方）
标准曲线的抗坏血酸储备溶液I（参见配方）

设备

一次性使用15 ml塑料管
0.45μm尼龙过滤器（25mm直径）（AnálisisVínicos，目录号：E0036）
冷冻离心机（15 ml管）
Polytron（Kinematica AG，型号：PT-1035 GT; http://www.kinematica.ch/en.html ）
具有光电二极管阵列检测器（PDA，Dionex）的HPLC系统
Ultrabase C 18柱（100×4.6mm，2.5μm）

软件

Chromeleon版本6.80（Dionex）

程序

抗坏血酸提取
1. 重悬在4毫升的冷冻的地面柑橘flavedo或纸浆组织（0.5克） 0.1％MPA在15ml一次性塑料管中并保持在冰上。的冷冻的组织先前用研钵和杵捣碎液氮。
2. 使用Polytron匀浆器以最大速度（30,000rpm）将组织匀浆1分钟
3. 在4℃下以4,000×g离心匀浆10分钟
4. 收集上清液，并保存在新鲜的15毫升一次性塑料管在冰上
5. 使用4 ml甲醇激活Sep Pak C18柱随后用4ml Milli-Q水和4ml 2％MPA洗涤它们。丢弃从洗涤步骤的解决方案
6. 对于抗坏血酸在flavedo中的测定取1ml上清液并将其与3ml混合 0.1％MPA（1:4稀释）。对于抗坏血酸在纸浆中的测定没有稀释，只要继续使用全部上清液的协议
7. 过滤在步骤A4（纸浆）或A6（淡黄色）中获得的溶液，通过使用注射器预先活化的C18 Sep Pak柱。将滤液收集在新鲜的15ml一次性塑料管中
8. 用4 ml 2％MPA洗涤C18 Sep Pak柱。将洗脱液与来自步骤A7的溶液一起收集
9. 通过0.45μm尼龙过滤器过滤步骤A8的溶液使用注射器。添加此步骤以确保解决方案是干净的的任何可能损坏HPLC色谱柱的颗粒
10. 用4ml 2％MPA洗涤过滤器，并与步骤A9的滤液一起收集
11. 测量最终体积，并将其与初始稀释（在flavedo样品的情况下）用于计算的抗坏血酸浓度
12. 用1ml最终提取物（来自步骤A10）制备琥珀色HPLC小瓶用于抗坏血酸测量。
脱氢抗坏血酸提取
通过加入DTT将脱氢抗坏血酸转化成抗坏血酸，然后测量总抗坏血酸（脱氢抗坏血酸+抗坏血酸）的量，并且从抗坏血酸减去总抗坏血酸得到脱氢抗坏血酸浓度（参见步骤D3）。
1. 将200μl等分试样的最终提取物（步骤A10）转移到琥珀色HPLC小瓶中
2. 在室温下用100μl200mM DTT在400mM Tris碱（pH8.5）中孵育15分钟。
3. 通过用100μl的8.5％正磷酸酸化停止反应。
抗坏血酸和去氢抗坏血酸HPLC测量
1. 为了量化抗坏血酸浓度，注入10μl的溶液在装备有光电二极管阵列的HPLC中从步骤A10获得检测器和Ultrabase C 18柱（100×4.6mm，2.5μm）。设置列温度在35℃。使用甲醇的等度流动相：Milli-Q 水（pH 2.5）（15:85，v/v，用MPA调节的pH），流速为0.2ml/min。
2. 量化在248 nm处显示最大值的峰下面积（抗坏血酸吸收在210和300nm之间，最大在248nm）。该区域应用于在D2中描述的公式以计算抗坏血酸浓度。测量之间的光谱 200和450 nm，用PDA检测器确认纯的定量抗坏血酸
3. 以获得脱氢抗坏血酸浓度使用其注射10μl从步骤B3获得的溶液设备和条件在步骤C1中描述
4. 量化区域在248nm处显示最大值的峰下。应用此区域到公式描述在D3中以计算脱氢抗坏血酸样品的浓度。测量200和450 nm之间的光谱用PDA检测器确认纯抗坏血酸的定量酸。
抗坏血酸和脱氢抗坏血酸定量
1. 使用一系列抗坏血酸稀释液制备校准曲线并测量跟在表1中的峰面积程序，如第C节所述。
2. 调整线性函数的抗坏血酸浓度对峰面积，并使用斜率计算未知样品的浓度公式：
3. 脱氢抗坏血酸浓度：
  
  x2是包括在公式中，因为它是由于稀释因子在步骤B2-3中添加200μl的额外体积。

食谱

0.1％MPA
1.5g MPA 65％
900毫升Milli-Q水，并在用Milli-Q水完全溶解后达到1000毫升溶液可以无限期储存在室温下。
2％MPA
31克MPA 65％
900毫升Milli-Q水，并在用Milli-Q水完全溶解后达到1000毫升溶液可以无限期储存在室温下。
8.5％正磷酸 10ml 85％的正磷酸 90毫升Milli-Q水，并无限期储存在室温下
400mM Tris碱（pH9.0）将12.1g Tris碱溶解在200ml Milli-Q水中
加入Milli-Q水至最终体积为250ml，在4℃保存三个月。
200mM DTT的400mM Tris碱（pH8.5）中将0.031g DTT溶解在1ml 400mM Tris碱溶液中并涡旋
不要储存，此溶液必须每天新鲜准备
甲醇：Milli-Q水（pH 2.5）（15:85，v/v）
将850ml甲醇HPLC级与150ml pH2.5的Milli-Q水混合（用2％MPA调节pH）

标准曲线的抗坏血酸储备溶液I（100mg/ml，在2％MPA中）
表1.校准曲线准备

抗坏血酸溶液	最终浓度	组合
库存解决方案	100 mg/ml	100mg抗坏血酸+ 1ml 2％MPA
库存解决方案II	1 mg/ml	990μlMPA 2％+10μl储备溶液I
A	100μg/ml	900μlMPA 2％+ 100μl储备液II
B	50μg/ml	500μlMPA 2％+500μl溶液A
C	25μg/ml	500μlMPA 2％+500μl溶液B
D	12.5μg/ml	500μlMPA 2％+500μl溶液C
E	6.25μg/ml	500μlMPA 2％+500μl溶液D
F	3.125μg/ml	500μlMPA 2％+500μl溶液E
G	1.5625μg/ml	500μlMPA 2％+500μl溶液F
H	0μg/ml	500μlMPA 2％

致谢

这项工作得到研究补助FP7-PEOPLE-2011-CIG-2011-303652（Marie Curie Actions，European Union），Proyectos de I + D para Grupos deInvestigaciónEmergentes GV/2012/036（Generalitat Valenciana，Spain）的支持。 EnriquetaAlós获得由Fondo Social Europeo de Desarrollo Regional（FEDER）共同资助的JAE-Doc（CSIC）博士后合同。这个协议是基于手稿Alós等人在（2014）上使用的方法。

参考文献

Alós，E.，Rodrigo，M. J.和Zacarías，L.（2014年）。柑橘类水果皮和果肉中L-抗坏血酸含量的差异转录调控在发育和成熟期间。 239（5）：1113-1128。