材料和试剂

要测定的细胞[在本方案的开发中，我们使用恶性疟原虫（3D7株）细胞培养物和人红细胞（由澳大利亚红十字会友情提供）]
< sup> 13 C-U-葡萄糖（Cambridge Isotope Laboratories，目录号：CLM1396）
注意：¹³ C-U-葡萄糖是指通用标记的葡萄糖，即其中所有六个碳都是^{13个C原子。}
己糖激酶（> 130单位/mg）（Sigma-Aldrich，目录号：H4502）
腺苷三磷酸（ATP）（Sigma-Aldrich，目录号：A6419）
氯化镁（MgCl 2，AnalaR）（VWR International，目录号：25108.260）
Tris-HCl（pH7.5）（Sigma-Aldrich，目录号：T5941）
氯化铵（NH 4 Cl）（Ajax，目录号：31-500G）
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD +）（Sigma-Aldrich，目录号：N3014）
NaHEPES（pH7.4）（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
乙二醇四乙酸（Sigma-Aldrich，目录号：E3889）
二硫苏糖醇（Sigma-Aldrich，目录号：D0362）
肌动蛋白（以下缩写为'em'I'）（Sigma-Aldrich，目录号：I8132）。
葡萄糖-6-磷酸（Sigma-Aldrich，目录号：G7879）
肌醇3-磷酸（Cayman Chemical Company，目录号：CAY10007778）
氯仿（HPLC级）（Thermo Fisher Scientific，目录号：10615492）
甲醇（HPLC级）（Thermo Fisher Scientific，目录号：10767665）
测试缓冲区（参见配方）
裂解缓冲液（见配方）

GC-MS 所需的其他材料
甲氧基胺盐酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：226904-25G）
吡啶（Sigma-Aldrich，目录号：270970）
BSTFA + 1％TMCS（Sigma-Aldrich，Supelco，目录号：33148）
葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G8270）

设备

1.5 ml管（带安全锁盖）（Eppendorf）
台式离心机用于1.5 ml管
1 ml，200μl和20μl移液器和附带的提示
37°C水浴
沸水浴
计时器
蒸馏（例如 MilliQ）供水
光学显微镜，载玻片和盖玻片（用于评价裂解）
台式涡流或水浴超声仪（可能需要有效裂解）

GC-MS 所需的其他设备
气相色谱 - 质谱仪（例如Agilent 7890B-5977A）
DB-5MS + DG柱（30m×0.25mm，具有10m惰性间隙）（Agilent，J& W）
超高纯氦
1.5ml管（Eppendorf）
用于质谱的2ml玻璃小瓶（例如Agilent，部件号：5182-0715）
带玻璃小瓶隔片的9 mm帽（例如Agilent，部件号：5185-5820）
250μl小瓶插入物（玻璃）（Agilent，部件号：5183-2085）
旋转真空浓缩器（例如 Christ，型号：RVC 2-33 CD Plus）
微分配器和伴随的玻璃毛细管（50μl可调，200μl）（Drummond Scientific Company）

软件

化学工作站软件（MSD ChemStation D.01.02.16）（Agilent）

程序

注意：可以在附图中看到整个过程的概述。

图1.肌醇3-磷酸合酶测定：概述

产生13 C-葡萄糖-6-磷酸
1. 通过将[300μM]终末期13号CU-葡萄糖与[66μg/ml]葡萄糖一起温育，产生13 C-葡萄糖-6-磷酸。 -1]终止己糖激酶在测定缓冲液中37℃ 10分钟，然后煮沸10分钟以变性己糖激酶。然后将试管转移到冰上注意：我们总是产生 ¹³ C-葡萄糖6-磷酸盐反应。我们重组冻干己糖激酶粉末（> 130U/mg）的10mg/ml水溶液。将其加入到测定中缓冲液，每1ml测定缓冲液为6.8，得到68μg/ml的浓度。制备（在水中）10mM的α-1,3-葡萄糖的储备液，并加入以每1ml30μl的己糖激酶/测定缓冲液，得到最终的浓度的300μM的13 C-U-葡萄糖和66μg/ml的己糖激酶。没用过反应产物储存在-80℃以备将来使用。
2. 这种转化的效率通常为〜100％并且可以通过评价标准气相色谱 - 质谱（GC-MS）方案糖/糖 - 磷酸分析[见下文，MacRae等人（2014）和 Saunders等人（2011）了解详情]。
生成细胞裂解物和INO1测定
1. 选择的细胞的裂解物通过悬浮洗涤的细胞制备丸粒（具有> 10个丸粒体积的冰冷PBS，两次）冰冷的裂解缓冲液中10分钟。
  注意：
  1. 测量时 INO1活性在恶性疟原虫感染的红细胞，细胞中以10 9个细胞/ml缓冲液的浓度悬浮（as 通过在第二次PBS洗涤时的细胞计数确定）。然而，悬浮液缓冲液的体积可能需要改变取决于INO1的总细胞数和体内活性。
  2. 应检查裂解物（通过光学显微镜检查）以确认成功裂解，一些搅拌（通过短暂涡旋或可能需要超声处理）。
2. 等分的13 C-葡萄糖-6-磷酸底物（50μl）和细胞裂解物（50μl）混合，涡旋混合短暂（<1秒），在37℃的水浴中温育，反应在所需时间点通过煮沸5分钟停止。管然后转移到冰注意：在我们的实验中，我们发现最大标记在〜3 h后实现，虽然我们也包括以后的时间点。典型的实验将包括0，0.5， 1分钟，5分钟，10分钟，30分钟，60分钟，120分钟，180分钟和240分钟，时间点，如果需要。
3. 然后离心反应溶液在16,100×g和4℃下5分钟（使细胞碎片沉淀），并且上清液（含有反应产物）转移到新鲜的1.5ml 管。
4. 极性产物通过50的溶剂萃取回收加入氯仿（50μl） μl），甲醇（150μl）和MilliQ水（100μl，含有1nmol In 作为内标），导致最终溶剂比为氯仿/甲醇/水（1：3：3v/v/v）。剧烈涡旋混合后（30秒）并在16,100×g和4℃下离心5分钟，这混合物产生两相，较低的氯仿相（〜50μl）和上层甲醇/水相（约300μl）
5. 13-葡萄糖的分析 6-磷酸和合成的肌醇3-磷酸可以是通过GC-MS容易地定量，通过与真实标准比较描述于下文和MacRae等人（2014）和Saunders 等人（2011）。
气相色谱 - 质谱（GC-MS）的样品制备
1. 将上极性相的等分试样（100μl）转移至GC-MS 小瓶插入物（置于1.5ml微量离心管中）并在旋转器中干燥真空浓缩器（RVC）。一旦干燥，额外100微升的极性相加入到插入物中并干燥。重复该过程直到几乎所有的上层相都被转移并干燥注意：小心不要转移任何富含脂质的下相或富含蛋白质的相间 - 建议离开几μl的极性阶段在分配管中而不是风险意外转移相间和下相。转移的任何小的差异通过归一化为内标（sI）进行校正。
2. 为了确保所有的水从干燥的极性相中移出，40μl 的甲醇并在RVC中干燥，然后再另外40℃ μl甲醇，然后干燥
3. 将小瓶插入物转移到具有镊子的2ml玻璃小瓶中，小心不要接触插入物的边缘。
4. 极性代谢物通过加入新鲜制备物而肟化 20mg/ml甲氧基胺的吡啶溶液（20μl，这应该是在需要时准备，i。 e。而第二等份的甲醇是干燥）。
5. 盖上小瓶，短暂涡旋（约5秒）并在室温下温育> 16小时。除去帽并甲羟肟酸样品通过加入20μlBSTFA + 1％TMCS（试剂）衍生化其导致在相关的三甲基甲硅烷基（TMS）取代代谢物，使其可以通过GC-MS观察到。小瓶是重新盖帽，短暂涡旋并在RT孵育≥1小时注射到GC-MS上。
气相色谱 - 质谱（GC-MS）
1. 衍生的样品使用不分流的DB-5MS + DG柱分析模式（注射温度270℃）或等效，使用超高纯度氦作为载气。
2. 初始炉温为70℃（2分钟），然后在12.5℃下温度梯度至295℃ ℃，以25℃/min从295℃至320℃。最终温度为保持3分钟。
3. 可以使用进行数据分析品牌特定的特定或非特定品牌的软件（例如 AnalyzerPro，Amdis，mzMatch，mzMine，等）。我们用随附的 ChemStation软件。
4. 通过比较鉴定代谢物的保留时间和离子碎片模式与真实标准。代谢物的定量使用公式：量代谢物（nmol）=（适当代谢物的面积峰值/峰值/峰值面积）×（1nmol/l/m）代谢物/MRRF值）。其中^代谢物是由以下确定的摩尔相对反应因子：平均值：适当代谢物峰的面积/峰的面积（1:1标准）。
  注意：
  1. "适当的峰"是提取离子色谱图（EIC）峰的适当的未标记和每个代谢物的标记离子（见下文）。
  2. 的级别标记估计为含有代谢物库的百分比一个或多个 ¹³ C原子（从未标记的标准计算），as 描述于Zamboni et al。（2009）。
5. 用于定量和标记结合计算的离子：
  scyllo -Inositol（ s I，internal standard）：M ₀ = m/ z 318
  肌醇3-磷酸：M sub -M sub 4 = m/em z 318-322
  葡萄糖：M M4 = m/ 319-323
  葡萄糖6-磷酸：M sub 0 -M sub 2 = m/z 357-359
  em] 。

食谱

测定缓冲区
1 mM ATP
2.5mM MgCl 2 v/v 100mM Tris-盐酸（pH7.5） 14mM NH 4 Cl
0.8 mM NAD ⁺
裂解缓冲液
1mM NaHEPES（pH7.4） 2mM乙二醇四乙酸 2mM二硫苏糖醇

致谢

这项工作得到澳大利亚国家卫生和医学研究委员会（NHMRC）的项目资助。 M.J.M是NHMRC首席研究员和J.I.M. 得到了皇家学会旅行奖学金的支持。

参考文献

MacRae，J.I.，Lopaticki，S.，Maier，A.G.，Rupasinghe，T.，Nahid，A.，Cowman，A.F.and McConville，M.J。（2014）。恶性疟原虫依赖于 de novo em> myo-inositol biosynthesis for assembly of GPIglybids and infectivity。 Mol Microbiol 91（4）：762-776。
Saunders，E.C.，Ng，W.W.，Chambers，J.M.，Ng，M.，Naderer，T.，Kromer，J.O.，Likic，V.A.and McConville，M.J。（2011）。利什曼原虫墨西哥前鞭毛体的同位素体分析揭示了琥珀酸发酵和天冬氨酸在三羧酸循环中的吸收的重要作用（TCA ）anaplerosis，glutamate synthesis，and growth。 J Biol Chem 286（31）：27706-27717。
Zamboni，N.，Fendt，S.M.，Ruhl，M。和Sauer，U。（2009）。（13）基于C的代谢通量分析 Nat Protoc < em> 4（6）：878-892。