材料和试剂

HEPES（Serva，目录号：25245）
EDTA（Merck KGaA，目录号：108418）
Dispase在HBSS（BD Bioscience，目录号：354235）中
胶原酶D（Roche Diagnostics，目录号：11088866001）
DNAse I（Sigma-Aldrich，目录号：DN25）
4％（v/v）FCS（PAN Biotech，目录号：P30-3302）
冰冷PBS（Gibco，目录号：14190-094）
HBSS（Gibco，目录号：14175-053）
Percoll（GE Healthcare，目录号：17-0891-01）
10x PBS（Ambion，目录号：AM9624）
RPMI（Gibco，目录号：21875-034）
细胞解离缓冲液（CD缓冲液）（参见配方）
消解解决方案（参见配方）
40％percoll（见配方）
80％percoll（见食谱）

设备

培养箱（New Brunswick Scientific，恒温摇床G25）
15ml管（Greiner Bio-One，目录号：188161）
离心机（Thermo Scientific，型号：Multifuge X1R）

程序

移除后，小肠从周围的结缔组织释放，并纵向切开以便通过冰冷的PBS洗出粪便。
为了关注固有层白细胞，使用细胞解离缓冲液（CD缓冲液）除去上皮内白细胞和上皮层。
注意：包括组织类型和pH的几个因素影响细胞解离过程的有效性。因此，我们使用EDTA作为螯合剂，HEPES作为缓冲细胞解离的缓冲成分。
将肠与10ml CD缓冲液在37℃和100rpm下温育10分钟
将样品强烈涡旋，将肠转移到10ml新鲜CD缓冲液中，并在37℃和100rpm下重复孵育10分钟。
将样品剧烈涡旋，用解剖刀将肠切成小块，并加入5ml消化溶液。
将样品在37℃和100rpm下孵育20分钟，涡旋，使未消化的组织通过沉降在地面上收集，并在冰冷的收集管中小心转移液相。
将另外5ml的消化溶液加入到未消化的肠组织中，在37℃和100rpm下温育20分钟，并将液相收集循环重复两次。
含有中性白细胞的肠白细胞与基质细胞（其与白细胞一起从固有层中移出）与percoll梯度分离。
将消化的肠在4℃下离心（10分钟，450xg），小心弃去上清液，将沉淀重悬于5ml 40％percoll中。
将该悬浮液小心地装载在15ml管中的5ml 80％percoll上，产生具有尖锐边界的40％/80％梯度。
将梯度在4℃（20分钟，700×g）下以轻微的加速度离心，不使用离心机的制动器。
收获含有固有层白细胞的中间相（约5ml）。在一个健康小鼠的小肠中，可以分离出高达1000万个白细胞
细胞应用PBS洗涤以清除残留物percoll
可以通过流式细胞染色和分析检查细胞的纯度

代表数据

数百万白细胞可以从健康小鼠的肠道中分离出来。

笔记

在冰上收集的细胞的快速工作和冷却优化了分离的白细胞的数量。在进行目的实验以洗出Percoll之前，应用PBS洗涤细胞。

食谱

细胞解离缓冲液（CD缓冲液）
10 mmol/L HEPES
6.4 mmol/L EDTA
在HBSS中解决
消化解决方案
250 H在HBSS中的释放
2.5mg胶原酶D
2.5mg DNAse I
4％（v/v）FCS
40％percoll
40％（v/v）percoll和10％（v/v）10x PBS的RPMI中
80％percoll
80％（v/v）percoll和10％（v/v）10x PBS的RPMI中

致谢

这项工作是由DFG（ZE872/1-2个人授权RZ）支持。

参考文献

Schwab，L.，Goroncy，L.，Palaniyandi，S.，Gautam，S.，Triantafyllopoulou，A.，Mocsai，A.，Reichardt，W.，Karlsson，FJ，Radhakrishnan，SV，Hanke， Graeff，A.，Freudenberg，M.，von Loewenich，FD，Wolf，P.，Leonhardt，F.，Baxan，N.，Pfeifer，D.，Schmah，O.，Schonle，A.，Martin，SF，Mertelsmann R.，Duyster，J.，Finke，J.，Prinz，M.，Henneke，P.，Hacker，H.，Hildebrandt，GC，Hacker，G.and Zeiser，R。（2014）。在肠细菌移位时募集的中性粒细胞通过组织损伤增强移植物抗宿主病。 a> Nat Med 20（6）：648-654。