材料和试剂

人类肿瘤细胞系
在来自活细胞或组织起源的免疫缺陷小鼠中生长的人肿瘤样品
Phos-tag TM TM丙烯酰胺（Wako Chemicals GmbH，目录号：304-93521，＃AAL-107）
λ蛋白磷酸酶（≥400,000单位/ml）（Calbiochem，目录号：539514-20KV）
抗KRAS（克隆Ab-1）小鼠mAb（Calbiochem，目录号：OP24）或针对假定标签的任何抗体-KRAS表达（HA标签已成功测试）
蛋白酶抑制剂终浓度
1. 抑肽酶：150nM（1μg/ml）（Sigma-Aldrich，目录号：A1153）（推荐储备液1mg/ml）
2. 亮肽素：20μM（10μg/ml）（Sigma-Aldrich，目录号：L2884）（推荐储备液1mg/ml）
3. 苯基甲磺酰氟（PMSF）：1mM（Sigma-Aldrich，目录号：S6508）（推荐储备溶液100mM）
磷酸酶抑制剂
1. 原钒酸钠：0.2mM（Sigma-Aldrich，目录号：S6508）（推荐储备液200mM）
2. 氟化钠：5mM（Sigma-Aldrich，目录号：S7920）（推荐储备液1M）
IGEPAL CA-630（Sigma-Aldrich，目录号：I8896）
用于免疫沉淀的Dynabeads Protein G（Novex by Life Technologies，目录号：10003D）
Temed
13％过硫酸铵（APS）
MnCl 2缓冲液10mM和25mM
λ磷酸酶裂解缓冲液（参见配方）
3x SDS样品缓冲液（见配方）
电泳缓冲液（见配方）
传输缓冲区（请参阅配方）
5 mM Phos标签储备液（见配方）
20x PBS（请参阅配方）
SDS-PAGE的解决方案1（参见配方）
SDS-PAGE的解决方案2（参见配方）
SDS-PAGE的解决方案3（参见配方）
解析Phos-tag的12％SDS-PAGE微型凝胶（1.5 mm厚）的组成（参见配方）
12％SDS-PAGE微型凝胶（1.5mm厚）的堆叠组合物（参见配方）

设备

组织研磨机（Dounce）（1ml）（Wheaton，目录号：357538）
Magnet DynaMag ^TM -2（Life Technologies，目录号：12321D）
管旋转器（Bibby Scientific Ltd.，Stuart SB2）

程序

样品裂解和λ磷酸酶处理

所有样品
1. 对于分析的每个样品（样品A），阴性对照（样品B）用λ磷酸酶处理。准备两个管用冰冷的λ磷酸酶裂解缓冲液，新鲜制备，含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂（A）或仅蛋白酶抑制剂（B）。
  
  图1 样品裂解和λ磷酸酶处理的流程图
对于单元格行
1. 用10毫升冰冷的磷酸盐缓冲盐水（PBS）从10厘米培养皿（80％汇合）洗涤细胞两次。
2. 刮细胞与1毫升冰冷PBS，收集在两个1.5毫升microfuge 管A和B（各500μl），并在4℃以1,000xg转速旋转3分钟。弃去上清液。
3. 加入18μl冰冷的λ磷酸酶裂解缓冲液仅含有蛋白酶抑制剂至沉淀B和接下来2μl 的λ蛋白磷酸酶（40单位/μl终浓度）。孵化在干燥块中在30℃下干燥30分钟
4. 加入180μl冰冷的λ 磷酸酶裂解缓冲液含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂到沉淀A.通过吸移和10分钟后重悬浮沉淀冰，在4℃下以10,000×g离心10分钟。转移上清液到新的1.5ml管（样品裂解物A）
5. 加入160μl冷的λ磷酸酶裂解缓冲液中含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂颗粒B.重悬沉淀，在冰上10分钟后，旋转10分钟在4℃下以10,000×g离心。将上清液转移到新的1.5ml管中（样品裂解物B）
6. 通过Lowry方法分析从步骤4-5获得的上清液的蛋白质含量。
对于肿瘤样本
1. 取相同肿瘤的两个片段，每个约0.1g。离开每个肿瘤片段在冰上在0.4ml的存在下在35mm培养皿上的含有蛋白酶和磷酸酶的冷的λ磷酸酶裂解缓冲液抑制剂（盘样品A）或仅蛋白酶抑制剂（盘样品B），但在任何情况下都不是DTT和MnCl 2（将在步骤5中添加）。剁碎肿瘤在最小的可能的部分用解剖刀和剪刀和收集所有体积，包含切碎的组织和裂解缓冲液，在1.5毫升微量离心管。
  注意：如果样品是冻结的肿瘤，肿瘤在存在缓冲液时必须进行，而肿瘤是解冻。
2. 在冰上用组织研磨机匀化样品，直到悬浮液中没有残留块。
3. 在4℃下在10,000×g下旋转管5分钟以丢弃未溶解的组织并收集新管中的上清液。样品体积获得约300μl
4. 如果肿瘤是小鼠异种移植物，它方便用Dynabeads蛋白G按顺序澄清样品以消除可能浸润肿瘤的推定的小鼠Ig 从而干扰磷酸化KRAS检测：
  1. 转移30微升Dynabeads（以前涡旋）到管
  2. 使用Magnet DynaMag ^TM分离Dynabeads与溶液，丢弃上清液，从磁铁中取出试管并洗涤 dynabeads用λ磷酸酶裂解缓冲液（1ml，无抑制剂）
  3. 用磁铁将Dynabeads从缓冲液中分离，丢弃缓冲液，并从磁铁上取下管子。
  4. 孵育Dynabeads与样品在管旋转器中20分钟以允许在4℃温和混合。样品的体积为约300μl （步骤3中得到的上清液的体积）
  5. 分开 Dynabeads从样品与磁铁和转移澄清样品A和B到新管。测量澄清样品的体积。
5. 向澄清的样品A和B中加入5mM DTT（来自储备1M DTT）和2mM MnCl 2（来自储备25mM MnCl 2）。轻轻混合。 />
6. 取40μl的样品B到新管，加入4μl的λ蛋白磷酸酶，并在30℃孵育30分钟。样品B的其余部分舍弃。
7. 向样品B中加入磷酸酶抑制剂：0.2μl的1M 氟化钠和0.4μl20mM原钒酸钠（或0.04μl 200 mM原钒酸钠）加入到40μl样品B中达到5mM氟化钠和0.2mM原钒酸钠最终浓度，在材料部分中说明。
8. 通过Lowry方法分析来自步骤5的样品A和来自步骤A6的样品B的蛋白质含量。
样品制备和Phos-tag SDS和转移
1. 转移20微克每个样品在10微升的最终体积与λ 磷酸酶裂解缓冲液，加入5μl样品缓冲液3x。煮沸样品在1.5ml管中1分钟
2. 将样品加载到用100μMPhos标签和100μMMnCl 2补充分辨凝胶的12％SDS-PAGE微型凝胶中。
3. 在4℃下以5mA /凝胶运行凝胶12小时至15小时
4. 用含有1mM EDTA的普通转移缓冲液浸泡凝胶两次 20分钟，用无EDTA一般转移缓冲液洗涤10分钟
5. 将蛋白质从凝胶转移到PVDF在70 V下3小时
6. 用适当的抗体：抗K-RAS进行Western印迹抗体或针对推定的标签KRAS表达的任何抗体。

代表数据

在皮下注射表达可磷酸化的致癌KRAS（KRASG12V S181）的NIH3T3细胞后，来自小鼠中肿瘤发展的样品的Phos标签SDS-PAGE，随后使用抗KRAS抗体的蛋白质印迹的代表性实例显示于图2中。 >

图2。代表数据。 1. K-RasG12V S181肿瘤。非温育样品; 2.K-RasG12V S181肿瘤。非温育样品; 3.K-RasG12V S181肿瘤。在4℃孵育，无磷酸酶λ; 4.K-RasG12V S181肿瘤。在30℃孵育，无磷酸酶λ; 5. K-RasG12V S181肿瘤。在30℃下用磷酸酶λ孵育。

笔记

从具有高蛋白质浓度的样品（至少3μg/μl）开始是重要的，以获得清楚的结果
当加载凝胶时避免使用蛋白质分子量标记，因为在存在Phos-标签试剂的情况下，迁移率与分子量不成比例。
加载凝胶时，离开第一和最后一道样品，避免凝胶变形
KRAS磷酸化带与未磷酸化带相比总是被延迟，但是带之间的距离可以根据样品（内源性KRAS，在细胞中或在肿瘤中表达的标签-KRAS等）而变化。为了正确解释结果，用λ磷酸酶处理的对照样品必须在每个实验中同时进行测定。
Phostag-PAGE凝胶与正常PAGE凝胶相比相当脆弱。在操作它们时要格外小心。
尽可能地装载新制的样品，避免样品长期重新装载。磷酸-RKAS-Phostag复合物似乎对长期储存敏感，因为P-KRAS带最终在一段时间后消失。
凝胶运行条件和Phos标签浓度可能需要对每种细胞系，肿瘤类型，治疗等进行优化。
建议在与Phos标记凝胶同时在同一电泳室中在通常的SDS-PAGE凝胶（不加入Phos-标签）中运行样品，因为染料前沿在Phos标记中难以看到和跟踪凝胶。

食谱

λ磷酸酶裂解缓冲液
50mM Tris-HCl（pH8）
150mM NaCl 2mM EDTA 10％甘油 1％IGEPAL CA-630
dH 2 2 O 新添加：
来自库存1 M DTT的5mM DTT
2mM MnCl 2来自原料25mM MnCl 2/v/v 蛋白酶和磷酸酶抑制剂（股票参见材料和试剂）
制备含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的5ml磷酸酶裂解缓冲液：
5μl抑肽酶
50μl亮抑酶肽
50μlPMSF
5μl原钒酸钠
25μl氟化钠
3x SDS样品缓冲液
0.5M Tris-HCl（pH 6.8）
1.5mg溴酚蓝
0.60克SDS
3ml甘油 3.9毫升巯基乙醇将dH 2加到10ml ml/h
电泳运行缓冲液
25mM Tris-HCl（pH8.3）
192mM甘氨酸 0.1％SDS
传输缓冲区
25mM Tris-HCl（pH8.3）
192 mM甘氨酸 0.02％SDS
20％乙醇
5 mM Phos标签储液
将置于0.10ml甲醇中的小塑料管中的油状产物Phos-tag TM TM丙烯酰胺（10mg）重悬。
通过移液
用3.2ml蒸馏水稀释溶液将溶液储存在2 ml微管中，在4°C在黑暗
20x PBS（pH 7.2）
170克NaCl
21.5g Na 2 HPO 4 H 2 2H 2 O
7.0g NaH 2 PO 4 PO 4·H 2 O
将dH <2> O添加至1,000 ml
对于PBS（1x）
250 ml PBS（20x）
4,750ml dH 2 O n /
SDS-PAGE的解决方案1
Tris-HCl 0.75M（pH 8.8）
SDS 0.2％
SDS-PAGE的解决方案2
30％丙烯酰胺 0.8％双丙烯酰胺
SDS-PAGE的解决方案3
Tris-HCl 0.25M（pH 6.8）
SDS 0.2％
用于Phos-tag SDS的12％SDS-PAGE微凝胶（1.5mm厚）的组成 5ml溶液1
4 ml溶液2
1ml dH 2 O 2 / 200μlPhos标签储备液5 mM
100μlMnCl 2储备溶液10mM
14μl温度
50微升APS 13％
12％SDS-PAGE微凝胶（1.5mm厚）的堆叠组合物 0.36ml溶液2
1.5ml溶液3
1.2ml dH 2 O 2 / 7.5μl温度
30微升APS 13％

致谢

我们感谢马拉加大学（西班牙）副教授JoséLozano和巴塞罗那分子生物学研究所（ibmb）高级研究科学家Maribel Geli在设立条件时提供有用的意见。该技术是由MICINN-Spain（SAF2010-20712）和RTICC（MINECO-Spain;组RD12/0036/0049，RD12/0036/0031和RD12/0036/0034）支持的研究的一部分。 C.Barceló和N. Paco分别是来自MEC-Spain和Generalitat de Catalunya的preoctoral奖学金的获得者。

参考文献

Barceló，C.，Etchin，J.，Mansour，MR，Sanda，T.，Ginesta，MM，Sanchez- Arevalo Lobo，VJ，Real，FX，Capella，G.，Estanyol，JM，Jaumot， AT和Agell，N。（2014）。核糖核蛋白HNRNPA2B1与胰腺导管腺癌细胞中的致癌性KRAS相互作用并调节致癌性KRAS。 Gastroenterology 147（4）：882-892 e888。
Barceló，C.，Paco，N.，Morell，M.，Alvarez-Moya，B.，Bota-Rabassedas，N.，Jaumot，M.，Vilardell，F.，Capella，G。和Agell，）。肿瘤生长需要致癌KRAS的Ser-181处的磷酸化。 Cancer Res 74（4）：1190-1199。