材料和试剂

植物叶片（任何感兴趣的植物，例如瞬时表达感兴趣的构建体的拟南芥或本生烟草）
水
200μM鲁米诺L-012（Wako Chemicals USA，目录号：075-05111; http://www.wako-chem.co.jp/english/labchem/journals/wpu_bio1/10.htm ）

10μg/ml过氧化物酶，辣根过氧化物酶（AppliChem，目录号：A3791）

MAMP或任何感兴趣的激励者

已知的MAMP作为阳性对照（例如 flg22，几丁质寡聚体，等）

10x鲁米诺主混合物（见配方）

设备

剪刀
培训
小铲
96孔板，白色平底（例如，LIA-板，惠特，96孔，平底，Greiner Bio-One GmbH）或适用于单细胞仪器的试管
发光计，96孔板读数器（例如Centro LB 960，微孔板发光计，BERTHOLD TECHNOLOGIES）或单细胞仪器

程序

准备植物样品，在氧化爆发测量前一天
1. 标签适当地铺在一起，用去离子水填满一半
2. 切叶（更年轻或高度分化）的植物[重要：植物不应该花，不应太老（约4-6周）] 用剪刀和剪刀切掉叶子的边缘
3. 将小叶的剩余部分切成小块，大小相同（例如 3 ×3mm，片应当容易地装配到96孔板的孔中）。它建议你剪切比你多大约2到3倍的叶片需要。
4. 浮石叶片在水中的培养皿（方向无关紧要），避免浸入！
5. 覆盖样品并在室温下孵育过夜（或> 8小时），避免摇动。
在发光测量之前制备样品，第二天
1. 根据光度计（单细胞或多孔板读数器）90 μl水+10μl鲁米诺主混合物（10x）移液到每个孔中的新的96孔板。对于单电池发光计，这可能是根据测量比色杯的大小放大2倍至3倍。
2. 小心地每孔添加一片叶片，避免机械损坏和伤人！如果碎片非常小，也可以每孔使用两个。使用小铲，没有镊子！检查是否所有叶片都在中心，然后开始测量
3. 每计划处理准备约3-4次重复（每次在额外的孔中）; 不要忘记阴性（例如未治疗）和阳性对照;所有叶片应该有相同的大小！
光度计测量
光度计设置（96孔读数器）：每孔测量持续时间= 1秒（可能更短，取决于您的机器的限制）;循环时间可以根据总样品或使用的孔的数量以及一次测量的持续时间来设定。
注意：一些软件/程序根据测量持续时间和样品数量计算周期时间。重复测量周期/总时间应设置为适当监测信号20分钟至60分钟。建议最多只有一半的板被样品占用，因为第一个样品和最后一个样品的测量之间的时间差太长。一轮测量应小于60秒。如果您使用单电池光度计，您可能只是使用连续模式或使用类似的程序，如上所述。
1. 在用MAMP /诱导子诱导ROS突发之前，背景必须测量电平以确保发射光的恒定值随着时间的推移。通常测量约5-10分钟就足够了控制稳定的非振荡基线。如果基线不是常数在这个时间内背景测量可能会增加最多60分钟。
2. 中断背景测量并添加您的 MAMP或任何触发物质（通常1μl）轻微摇动平板水平地放在工作台上，并继续/重新开始测量。的可以通过使用集成在机器中的注射器来添加引出器，或通过直接移液到孔中。测量周期（30-60秒，每个）可以重复到总时间20-60分钟或更长时间必要。

代表数据

数据处理和评估
由于鲁米诺的氧化，监测的ROS突发被测量为发射光，并且以RLU（相对光单位）给出。由于RLU不是一个明确定义的单位，它可以随机器而变化。因此，难以比较用不同机器获得的结果。氧化爆发随时间的测量导致动力学曲线，如图1的示例性曲线图所示。对于实验，重要的是使用阴性和阳性对照，不同植物的叶片应具有相同的尺寸。重复（n≥3）具有相同大小的叶片总是需要执行统计

图1. ROS突发动力学曲线的示意图;通过发光计在基于发光氨的测定中检测ROS-爆发作为发射光。用MAMP（例如flg22）处理样品;1μl10μM储备溶液;最终浓度100 nM）导致良好的ROS爆发，在〜15分钟具有最大峰。通常观察到2-10分钟的滞后期。阴性对照（例如水，BSA，等）不引起ROS突发，并且相应的曲线不显示峰。

为了获得关于系统对于某一MAMP-触发的灵敏度的想法，以MAMP-剂量依赖性方式测量氧化爆发是不可缺少的。用不同剂量的MAMP处理适当量的样品，并如上所述记录ROS脉冲。获得的动力学曲线（图2左图中的实施例）可以加工成如图2所示的经典剂量 - 反应曲线（右图）。以这种方式，可以确定EC ₅₀，其直接指示生物系统对于具有任何触发的治疗的灵敏度。

图2.ROS-爆发响应的剂量依赖性。左图：用所示的不同浓度的MAMP处理样品，随着时间记录ROS作为发射光。最高浓度（1,000和100nM）给出类似的曲线，表明系统是饱和的。浓度为10和1nM的较低剂量产生具有较小幅度的曲线，并且0.1nM的剂量不会引起ROS增加超过对照处理中发现的水平（水，0nM）。右图：左边的最大值相对于相应的浓度绘图，并且该图显示了经典的剂量 - 反应曲线。〜10nM（半数最大值）的EC 50 有效浓度）是如图所示的示例性测定

食谱

10x鲁米诺主混合物
200μM鲁米诺L-012
10μg/ml过氧化物酶，辣根过氧化物酶

致谢

挪威研究委员会的Grant 348256/F20支持R.A.的工作; 和来自挪威研究委员会和Deutscher Akademischer Austausch Dienst的Grant 216856。 M. A.由Deutsch Forschungsgemeinschaft（AL1426/1-1）支持。该方法最近应用于Butenko等人（2014）。有效浓度）是如图所示的示例性测定

食谱

10x鲁米诺主混合物
200μM鲁米诺L-012
10μg/ml过氧化物酶，辣根过氧化物酶

致谢

挪威研究委员会的Grant 348256/F20支持R.A.的工作; 和来自挪威研究委员会和Deutscher Akademischer Austausch Dienst的Grant 216856。 M. A.由Deutsch Forschungsgemeinschaft（AL1426/1-1）支持。该方法最近应用于Butenko等人（2014）。... 有效浓度）是如图所示的示例性测定

食谱

10x鲁米诺主混合物
200μM鲁米诺L-012
10μg/ml过氧化物酶，辣根过氧化物酶

致谢

挪威研究委员会的Grant 348256/F20支持R.A.的工作; 和来自挪威研究委员会和Deutscher Akademischer Austausch Dienst的Grant 216856。 M. A.由Deutsch Forschungsgemeinschaft（AL1426/1-1）支持。该方法最近应用于Butenko等人（2014）。......