材料和试剂

细菌菌株（ Typhimurium）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
100％三氯乙酸（Sigma-Aldrich，目录号：T6399）
β-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M6250）
Trizma底物（粉末）（Sigma-Aldrich，目录号：T1503）
1M HCl溶液（Sigma-Aldrich，目录号：H1758）
甘油1L（Sigma-Aldrich，目录号：49781）
十二烷基硫酸钠500g（Sigma，目录号：L4390）
胰蛋白胨（BD目录号：211705）
酵母提取物（BD，目录号：212750）
琼脂（BD，目录号：281230）
溴酚蓝（Shelton scientific，目录号：IB74040）
一个小瓶的甘油储备（见配方）
LB介质（见配方）
1 M Tris（见配方）
2x SDS样品缓冲液（见配方）

设备

Falcon管（50ml和15ml）（TPP，目录号：91050和91115）
过滤瓶（孔径0.22μm直径）（TPP，目录号：99500）
Eppendorf管（1.5ml）（Sarstedt，目录号：72.690.001）
孵育器（调节至37℃）（Memmert，型号：ULE500）
旋转振荡器（HTINFORS，型号：Minitron）
分光光度计（日立，型号：U1100）
热块（PEQLAB，型号：1202）
涡旋混合器（VWR International，型号：1719）
Luer锁尖（BD PLASTIKPAK，目录号：302187）
针（0.51mm外径）（BD Microlance无菌，型号25g×5/8"×100）
无菌培养皿（90mm）（Sartorius，目录号：14-555-735）
离心机（HERAEUS，型号：PICO17）
微量离心机（NeoLab，型号：微量离心机II）
pH计（Hanna instruments，型号：pH211）

程序

预培养物的制备（用于所有后续培养条件）
第0天
条纹细菌菌株从LB琼脂板上的-80℃甘油储液[等于在LB中的87％（v/v）甘油]，用于单菌落。如果需要，使用含有适当抗生素的LB琼脂平板，并在37℃（约16至24小时）孵育过夜。
第1天
1. 取一个菌落并接种在10ml液体LB培养基（在50ml Falcon管中）
2. 在37℃下以150rpm振荡培养过夜。放盖子松动在管上。如果需要，加入适当的抗生素。
接种物的制备
第2天
1. 测量1:10稀释的预培养物在a中的光密度分光光度计并计算预培养物的光密度。对于1ml体积，将预培养物的OD 600调节至OD 600 = 1。对应于大约5×10 ⁸ CFU
2. 加入100μl的调整预培养至10ml LB培养基（1:100稀释）。
文化条件

在LB培养基中的标准生长条件为对数和稳定期
向50ml Falcon管（接种物的1:100稀释液）中的10ml LB培养基中加入100μl野生型，标准化的测试和对照接种物。如果需要，添加适当的抗生素和诱导剂
1. 对数期生长条件
  1. 孵育样品3小时在37℃下以150rpm振荡。将盖子松动放在管上。的 OD ₆₀₀约为0.6-0.8
  2. 将每个样品标准化至OD 600 = 0.6。如D所述剪切鞭毛。
2. 静止期生长条件
  1. 孵育样品16至24小时，在37°C，在150 rpm的摇动。将盖子轻轻放在试管上。
  2. 将每个样品标准化至OD 600 = 0.6。如D所述剪切鞭毛。
S。鼠伤寒沙门氏菌细胞培养物侵袭条件
1. 低氧，高盐生长条件。
  1. 加入100μl野生型，标准化的测试和对照接种到具有高盐的10ml LB培养基中在50ml Falcon管（接种物的1:100稀释液）中的浓度。如果需要，添加适当的抗生素和诱导剂
  2. 孵化样品在37℃下以150rpm振摇直至OD 600 = 0.6-0.7 （约需4.5小时）。将盖子轻轻放在试管上。
  3. 使用LB将样品的OD 600标准化为野生型OD 600 介质具有高盐浓度。如所述剪切鞭毛下D.
剪切细胞相关鞭毛蛋白（鞭毛）
1. 在冰上执行以下步骤。
2. 将5ml的每个标准化样品置于单个无菌培养皿板中
3. 从无菌培养皿板上提起接种物无菌Luer锁头（注射器）。将无菌针放在鲁尔锁定尖端并将细胞悬浮液弹回培养皿盘中。在干净的工作台上工作，因为此过程会产生气溶胶
4. 用相同的材料重复前面的步骤10次，以剪除细胞相关的鞭毛
5. 取1毫升细胞悬液，并转移到Eppendorf管。在4℃下以17,700×g离心10分钟。
6. 转移800微升的上清液到一个新的Eppendorf管。的上清液含有剪切的鞭毛和少量分泌的鞭毛蛋白。继续E，用于鞭毛准备。
7. 去除剩余的上清液。细菌沉淀用于分析细胞相关蛋白，如E所述，用于细胞相关蛋白质制备。
样品准备

对于鞭毛制备
1. 在4℃下以17,700×g离心10分钟。
2. 转移750微升到一个新的Eppendorf管
3. 加入250μl冷三氯乙酸溶液，轻轻混匀
4. 将样品在冰上或-20°C冰箱中放置至少1小时
5. 在4,700×g离心40分钟，除去上清液并去除残留的液体（最终通过重复离心）。
用于细胞相关蛋白制备
1. 在4℃下离心17,700×g，历时1分钟。
2. 丢弃剩余的上清液并保存细菌沉淀。
准备蛋白凝胶上的细胞相关蛋白和鞭毛蛋白样品
1. 用90（v/v）％1x SDS样品预缓冲液和10（v/v）％β-巯基乙醇制备样品缓冲液。
2. 将鞭毛蛋白制剂重悬在45μl样品缓冲液和5μlTris-HCl（pH = 9）中。
3. 将细菌沉淀重悬于100μl样品缓冲液中
4. 旋转样本。
5. 在95℃下加热样品5分钟
6. 旋转样本。
7. 用微量离心机旋转几秒钟。
  样品可立即使用或储存于-20°C用于进一步利用。

代表数据

图1.考马斯亮蓝染色的12％SDS来自沙门氏菌沙门氏菌沙门氏菌鼠伤寒沙门氏菌UMR1野生型和同基因鞭毛蛋白突变体的鞭毛制备物。 M. PageRuler预染色的蛋白梯1.野生类型：ATCC14028-1s Nal ^r; 2. UMR1 fli 5050 :: mu d J flj ：Mu Cm ^r; 3. UMR1 flj B 5001 :: Mu Cm ^r; 4. UMR1 fli C 5050 :: Mu 鞭毛蛋白的分子量：FliC：52kDa，FljB：53kDa

笔记

菌株和对照。
该方案是使用野生型菌株开发的。肠毒性鼠伤寒沙门氏菌UMR1（ATCC14028-1s Nal ^r）。在这种情况下，对照菌株是同基因的 em> B 和 fli 这些菌株可根据相应作者的要求获得。
中等体积和培养条件。
这些因素可能会发生变化。生长培养基，培养基体积和培养时间可以适应研究问题。
在步骤C1b，2b和3c中将样品标准化为OD 600 = 1，以便能够独立于生长培养物评估鞭毛蛋白表达。
细胞相关蛋白样品细胞相关蛋白样品将用于评估等量的细胞是否已用于鞭毛制备
鞭毛制剂样品的沉淀。
在向鞭毛蛋白样品中加入三氯乙酸溶液后，样品可以在-20℃下储存
在步骤C和D之间以17,700×g进行5分钟的补充离心可用于分离聚合的和单体分泌的鞭毛蛋白。

食谱

一个小瓶的甘油储备
250微升87％甘油 750微升细菌过夜培养物
LB培养基（1L）
10g胰蛋白胨
5g酵母提取物
10克NaCl
变体：具有高盐浓度17.5g NaCl（0.3M NaCl）
用去离子水填充至1 L，并将介质调节至pH = 7
高压灭菌或过滤灭菌
1mM Tris（调节至pH = 9）
向去离子水中加入12.14g Trizma ，总体积为100ml
用1M HCl溶液将pH调节至9
2×SDS样品缓冲液
25ml 0.5M Trizma碱（pH = 6.8） 20ml甘油87％
4 g SDS
0.2克溴酚蓝色
45ml H 2 O 2 / 使用前，向90％的1x样品缓冲液中加入10％β-巯基乙醇

致谢

该协议的制定由Karolinska机构博士资助（项目编号C112130052）和瑞典研究委员会自然科学和工程（项目编号621-2010-5755）的研究拨款支持。作者没有声明利益冲突。上述方案改变自之前报道的方案（Le Guyon等人，2014; Ahmad等人，2013）。 Kelly T. Hughes热情地提供了 fli 5050 :: Mu J和 flj em> 5001 :: Mu Cmr突变体等位基因在鼠伤寒沙门氏菌LT2中的表达。

参考文献

Ahmad，I.，Wigren，E.，Le Guyon，S.，Vekkeli，S.，Blanka，A.，El Mouali，Y.，Anwar，N.，Chuah，ML，Lünsdorf，H.，Frank，，Rhen，M.，Liang，ZX，Lindqvist，Y。和Römling，U。（2013）。 EAL样蛋白STM1697调节了沙门氏菌（Salmonella typhimurium）中的毒力表型，运动性和生物膜形成。 Mol Microbiol 90（6）：1216-1232。
Ikeda，JS，Schmitt，CK，Darnell，SC，Watson，PR，Bispham，J.，Wallis，TS，Weinstein，DL，Metcalf，ES，Adams，P.，O'Connor，CD和O'Brien，AD 2001）。沙门氏菌沙门氏菌的鞭毛相变化血清型鼠伤寒在鼠伤寒感染模型中有助于毒力，但不影响沙门氏菌诱导的肠道发生。感染免疫 69（5）：3021-3030。

Ibrahim，G.F.，Fleet，G.H.，Lyons，M.J.and Walker，R.A。（1985）。分离高度纯化的沙门氏菌鞭毛蛋白的方法。 J Clin Microbiol 22（6）：1040-1044。

Guyon，S.L.，Simm，R.，Rehn，M.and Romling，U.（2014）。剖析在沙门氏菌中调节运动的环状二鸟苷酸单磷酸酯信号网络 serovar Typhimurium。 Environ Microbiol。（Epub ahead of print）

Rochon，M。和Römling，U。（2006）。鞭毛蛋白与curli菌毛组合在胃肠上皮细胞系HT-29中引起免疫反应。/a> Microbes Infect 8（8）：2027-2033。

Römling，U。和Rohde，M。（1999）。 Flagella调节社区一级的鼠伤寒沙门氏菌的多细胞行为。/a> FEMS Microbiol Lett 180（1）：91-102。

Römling，U.，Bian，Z.，Hammar，M.，Sierralta，W.D.and Normark，S。（1998）。卷烟纤维在鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌之间高度保守关于操纵子结构和调节。 180（3）：722-731。