材料和试剂

植物材料
Flg22（鞭毛蛋白衍生的，22个氨基酸长的肽）（QRLSTGSRINSAKDDAAGLQIA）
100％乙醇
100％乙酸（Carl Roth，目录号：3738.5）
HPO 4（Carl Roth，目录号：P749.2）
苯胺蓝或水蓝（Fluka Chemika，目录号：95290）
甘油（Carl Roth，目录号：7530.4）
滤纸（Munktell，目录号：3.00343.080）
解决方案（参见配方）
洗涤溶液（见配方）
染色溶液（见配方）

设备

允许在染色溶液中漂浮植物材料的塑料设备（Grainer Falcon 50ml管，目录号：227261; Grainer6孔培养板，目录号：657160）
真空泵（Savant Systems LLC，目录号：SC110：25-30Hg）
使用UV灯（FluoArc/001.26B）和'DAPI'滤光片（激发滤光片390nm;分色镜420nm;发射滤光片460nm）的显微镜（Zeiss，型号：Axioplan 2ie）

程序

植物材料：
我们使用来自拟南芥植物或幼苗的分离的叶子，这取决于实验设置和实验的总体目的。植物和幼苗在两种不同的系统中生长：
1. 拟南芥植物在短日条件下（8/16小时）在土壤上生长日/夜光周期）在21℃下5周。诱导者之前挑战，将分离的叶漂浮在植物生长培养基（1/2MS）上 3天进行适当的预处理（图1A）。
2. 拟南芥种子经表面消毒，发芽，生长2天周在½MS植物生长培养基上。此后，转移幼苗在6孔板中的液体植物生长培养基中培养3天适当的预处理（图1B）。生长条件设定为 22℃，在8/16小时日/夜光周期中具有150μmol/m 2 s/s光照，65％相对湿度
  
  图1.植物材料，用苯胺染色蓝色和脱色。A.从5周龄土壤生长的拟南芥植物上分离的叶漂浮在植物生长培养基上。 B.将两周龄的拟南芥幼苗漂浮在6孔的植物生长培养基上板。 C.脱色后的半透明拟南芥幼苗。 D.拟南芥幼苗转移到苯胺蓝染色溶液中。 E-F。胼lose质沉积的显微可视化
用鞭毛蛋白（flg22）攻击植物以激活其防御反应。在幼苗的情况下，将flg22以100nM的终浓度加入培养基中24小时。对于分离的叶，喷洒1μMflg22溶液，然后短暂地真空浸润（具有漂浮叶的培养皿置于密闭的盒中，直到压力达到0.84巴），将叶在湿滤纸上孵育24小时。
孵育24小时后，将植物或叶子固定并在1:3乙酸/乙醇中脱色，直到材料透明（通常过夜），如果需要，替换饱和脱色溶液（图1C）。
固定和脱色的叶或幼苗在150mM K 2 HPO 4中洗涤30分钟。
将植物材料在包裹在铝箔中的Falcon管中在150mM K 2 HPO 4和0.01％苯胺蓝（染色溶液）中温育至少2小时，用于光保护（图1D）。
为了便于观察，在进一步分析之前将样品包埋在50％甘油中。包埋在50％甘油中允许延长的观察时间，并减少由气泡引起的扰动
使用DAPI过滤器在荧光显微镜中定量Callose沉积（图1E-F）。苯胺蓝的最佳激发波长为370nm，发射最大值为509nm。对于文档，我们使用Zeiss AxioVision 3.0软件。用1,300×1,030分辨率获得图像，除了亮度的调节之外不进行处理。一般来说，我们使用300毫秒的曝光时间

代表数据

有代表性的数据参见Schenk等人。（2014）。
有关再现性，请参见注释

笔记

可以通过计数限定的叶面积中的所有染色斑点容易地定量Callose沉积。此外，沉积物的量可以分组，从每个叶或叶面积的最低点到最高点的密度排列。用图像分析软件对胼cal质的强度进行定量也是可能的，然而图像的聚焦以可视化特定叶面积中的所有胼cal质沉积可能是困难的。为了实现结果的高再现性，重要的是在相等年龄的叶子上进行实验并且在样品制备期间在植物或叶子转移到不同溶液期间防止损伤。

食谱

脱色解决方案
1:3乙酸/乙醇
洗液
在200ml H 2 O中的5.2g的K 2 HPO 4子
染色溶液
1.3克K 2 HPO 4与5毫克苯胺蓝在50毫升H 2 O中的混合物

致谢

该方案在Clay等人（2009）后修改。这项工作得到了德国联邦农业和食品局（BLE）的支持。

参考文献

Clay，N.K.，Adio，A.M.，Denoux，C.，Jander，G.and Ausubel，F.M。（2009）。拟南芥先天免疫反应所需的葡萄糖苷酸代谢物科学 323（5910）：95-101。
Schenk，ST，Hernandez-Reyes，C.，Samans，B.，Stein，E.，Neumann，C.，Schikora，M.，Reichelt，M.，Mithofer，A.，Becker，A.，Kogel，KH和 Schikora，A。（2014）。 N-酰基 - 高丝氨酸内酯引物植物用于细胞壁增强并通过水杨酸诱导对细菌病原体的抗性酸/oxylipin途径。植物细胞26（6）：2708-2723。