材料和试剂

植物材料
Flg22（鞭毛蛋白衍生的，22个氨基酸长的肽）（QRLSTGSRINSAKDDAAGLQIA）
80％甲醇水溶液（Carl Roth，目录号：4627.6）
蒸馏水
丙酮（VWR International，目录号：UN1090）
NaOH（Carl Roth，目录号：6771.1）
86％H 3 PO 4（J.T.Baker ，目录号：6024）
乙酸乙酯（Carl Roth，目录号：6784.4）
硫代乙醇酸（Sigma-Aldrich，目录号：T3758）
32％HCl（Carl Roth，目录号：P074.3）
木质素（碱）（Sigma-Aldrich，目录号：370959）
1 M NaOH（见配方）
2 M HCl（见配方）

设备

塑料设备（Grainer Falcon 50ml管，目录号：227261; Grainer 6孔培养板，目录号：657160）
冷冻干燥机
Tissue Lyser2（由Retsch制造，由QIAGEN提供）和不锈钢珠（QIAGEN，目录号：69989）
用于管旋转的振动器（具有可变温度）
离心机（可变温度）（Eppendorf，离心机编号：5417R）
真空泵（Savant Systems LLC，目录号：SC110：25-30Hg）
用于管旋转的旋转振动器
光度计（Eppendorf，BioSpectrometer basic）

注意：提取程序包括根据酚类化合物的化学性质分离不同的酚类化合物。用80％甲醇萃取可溶性酚馏分（第1天）。将细胞壁结合的酚部分水解（碱性水解）并溶解在乙酸乙酯中。木质素级分在程序的后续步骤中通过结合至隐式巯基乙酸复合物（第2天和第3天）来提取。的可以在Strack等人（1988）之后根据Folin-Ciocalteau方法测量可溶性和细胞壁结合的酚部分，或用于进一步的HPLC分析。在NaOH中解析后可以直接测量木质素络合物。

程序

植物材料：将拟南芥种子表面消毒，发芽，并在1/2MS植物生长培养基（Murashige和Skoog，1962）上生长2周。此后，将幼苗在6孔板中转移到液体植物生长培养基中3天，以进行适当的处理。生长室设定为22℃，具有150μmol/m 2光照和8/16小时日/夜光周期。
为了诱导防御反应，用flg22攻击植物24小时。将Flg22直接加入浮在液体植物生长培养基上的拟南芥幼苗，最终浓度为100nM。
在15ml Falcon管中收获4g拟南芥叶并冷冻干燥（冻干）3天。
将两个技术重复（2×40mg）的拟南芥干叶置于2ml管中，并用组织裂解器中的金属珠匀浆（频率：30 /秒，30秒）。

第1天：开始提取
酚醛树脂萃取前，样品用铝箔防光
向样品（植物粉末）中加入1ml 80％甲醇水溶液，并在室温下连续振荡（120rpm）温育1小时以提取可溶性酚类化合物的第一部分。
接下来，将样品在4℃以13,000×g离心10分钟。
收集上清液。
将剩余的沉淀再次与1ml 80％甲醇水溶液在室温下孵育1小时
将样品在4℃下以13,000×g离心10分钟
将上清液合并，将沉淀物用于进一步提取
然后用1ml 80％甲醇水溶液，蒸馏水和丙酮洗涤沉淀
在每种情况下进行洗涤步骤15分钟（温育），然后离心（13,000×10分钟）。
用丙酮洗涤后，将粒料在SpeedVac中干燥10分钟
对于碱性水解，将干燥的沉淀物与1ml 1M NaOH在80℃下温育1小时，随后在室温下过夜。

第2天
通过向样品中加入100μl的86％磷酸（H 3 PO 4）来降低pH。
为了解决细胞壁结合酚类化合物，向样品中加入500μl乙酸乙酯，并将样品在室温下在旋转振荡器上温育30分钟。
在室温下以13,000xg离心5分钟后，将上层相（约500μl）收集在新管中。这种上清液含有细胞壁结合的酚类化合物
向剩余的样品中加入另外500μl的乙酸乙酯，并在旋转振荡器上孵育30分钟。
在室温下以13,000×g离心5分钟后，收集上层相（约500μl）并与前一步合并。两者都是细胞壁结合的酚类级分（约1ml）
对于木质素提取，向剩余样品（下相）中加入500μl80％甲醇水溶液，并通过离心（13,000×g 10分钟）沉淀样品。
所得颗粒用1ml 80％甲醇，蒸馏水和丙酮洗涤，如点13
用丙酮洗涤后，将粒料在SpeedVac中干燥10分钟。
将1.5ml 2M HCl和0.3ml巯基乙酸加入到干燥的沉淀中，并在95℃下定期摇动孵育4小时。
将样品在冰上短暂冷却，并在室温下以13,000xg离心5分钟。
除去上清液。
将沉淀用蒸馏水洗涤两次，并在室温下以13,000×g离心10分钟。
将残余物与1ml 0.5M NaOH在振荡器上孵育过夜
第3天
过夜温育后，将样品在室温下以13,000×g离心5分钟。
收集上清液并储存在新的2ml管中
再次向剩余的丸粒中加入0.5ml NaOH并在室温下以13,000×g离心5分钟。
将上清液合并，用300μl32％HCl酸化，用于木质 - 巯基乙酸复合物沉淀。
将样品在4℃下连续振荡孵育4小时
此后，将样品在室温下以13,000×g离心5分钟
弃去上清液，将木质素沉淀溶于600μl0.5M NaOH中
木质素的定量在适当稀释（如果需要）后通过测量340nm处的吸光度进行。使用由木质素，碱制成的标准曲线进行校准（图1）

图1.木质素的标准曲线。木质素的比色显现在1至0.0001mg/ml的浓度范围内进行。将木质素溶解在0.5M NaOH中。用生物分光光度计测量340nm处的吸光度，并相应地计算回归线

代表数据

有代表性的数据参见Schenk等人。（2014）。
重复性见注释。

笔记

建议在整个萃取过程中在实验室通风橱下工作。用于粉碎植物材料的金属珠应在提取步骤的第一步中除去。为了重复性，应对干燥植物材料进行称重，以便进行充分计算，根和残留组织的含量在所有样品中应相同，并且干燥植物材料应通过TissueLyser均化至适当的粉末。

食谱

1 M NaOH
2g NaOH在50ml H 2 O中的溶液
2 M HCl
1.964ml在10ml H 2 O中的32％HCl

致谢

在Bruce和West（1989），Eynck等人（2009）和Strack等人（1988）后修改了该方案。这项工作得到了德国联邦农业和食品局（BLE）的支持。

参考文献

Bruce，R.J。和West，C.A。（1989）。蓖麻籽悬浮培养物中果胶片段对木质素生物合成和异过氧化物酶活性的诱导。 Plant Physiol 91（3）：889-897。
Eynck，C.，Koopmann，B.，Karlovsky，P。和von Tiedemann，A。（2009）。冬季油籽油菜的内部阻力抑制血管病原体长链口孢霉的全身传播。 Phytopathology 99（7）：802-811。
Murashige，T。和Skoog，F。（1962）。用烟草组织培养快速生长和生物测定的修订培养基。 Physiol Plantarum 15，473-497。
Schenk，ST，Hernandez-Reyes，C.，Samans，B.，Stein，E.，Neumann，C.，Schikora，M.，Reichelt，M.，Mithofer，A.，Becker，A.，Kogel，KH和Schikora，A。（2014）。 N-酰基 - 高丝氨酸内酯引物植物用于细胞壁增强，并通过水杨酸诱导对细菌病原体的抗性酸/oxylipin途径。植物细胞26（6）：2708-2723。
Strack，D.，Heilemann，J.，Momken，M。，和Wray，V。（1988）。来自coniferae叶的细胞壁缀合酚类。植物化学 27，3517-3521。