Materials and Reagents

Bacillus subtilis 168
NaCl
BD Bacto^TM tryptone (Difco, catalog number: 211705)
BD Bacto^TM yeast extract (Difco, catalog number: 212750)
Agar (Nissui, catalog number: 05835)
Tris（Wako Pure Chemical Industries，目录号：512-97505）
乙酸镁（Wako Pure Chemical Industries，目录号：139-15335）
乙酸铵（Wako Pure Chemical Industries，目录号：019-02835）
二硫苏糖醇（DTT）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：042-29222）
苯甲基磺酰氟（PMSF）
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：S0389-55G）
焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的水
注意：将DEPC以1％的终浓度加入蒸馏水中，然后在室温下储存2小时以上。将DEPC处理的蒸馏水高压灭菌两次（121℃，20分钟），并在室温下贮存。
LB介质（见配方）
缓冲区I（参见配方）
10-40％蔗糖溶液（见配方）

设备

2 L烧瓶，带棉塞
Innova 4080台式孵化器（新不伦瑞克科学）
法国压力电池压力机[Aminco International（USA），型号：FA-078]
Mini cell [Aminco International（USA），型号：FA-003]
梯度分馏器（BIOCOMP，目录号：152-001）
Gradient master [Aminco International（USA），目录号：107-201M]
微收集器（ATTO Technology，目录号：AC-5700P）
Nano drop 2000（Thermo Fisher Scientific）
高速冷冻离心机（例如，日立，型号：himac CR22GII）
角转子R10A3（固定角，最大：10,000rpm，18,800 x×g，体积：500ml×6）（日立）
离心机MX-300（TOMY）
TMA-300转子（固定角，最大：15,000rpm，20,380×g，体积：2ml×24）（TOMY）
TMA-27转子（固定角，最大：15,000rpm，21,130×g，体积：15ml×4,50ml×4）（TOMY）
离心管（Nalgene，目录号：3148-0050）
超离心机（例如，日立，型号：CP-60E）
P55ST2转子（旋转叶片转子，最大：55,000rpm，366,000×g ，体积：5ml×6）（日立）
P28S转子（旋转叶片转子，最大：28,000rpm，141,000×g ，体积：40ml×6）（日立）
P40ST转子（摆动转子转子，最大：40,000rpm，284,000×g，体积：13ml×6）（日立）
P40ST转子用敞口型多孔离心管（Seton Identification Products，型号：7031）
用于P28S转子的敞口型多孔离心管（Seton Identification Products，部件号：7052）
P55ST2转子离心机（日立，部件号：332245A）
注意：这些转子可以代替其他商业转子，可以按照相同的离心力使用。

程序

70S核糖体的粗制准备
1. B。枯草芽孢杆菌在单菌落中划线并在LB琼脂平板上在30℃下预温育14-16小时。
2. 细胞取自平板上的单个菌落，并悬浮于其中约10ml具有高浊度的LB培养基。细胞悬浮液稀释到OD OD 600为0.04的3L LB培养基中，在6个2升烧瓶中平均分配，每个烧瓶含有500ml 细胞培养。将烧瓶在37℃下在250℃下振荡孵育 rpm。
  注意：枯草芽孢杆菌常规培养的体积不超过所用瓶子体积的四分之一。
3. 当培养物的OD大于600时，通过离心收获细胞达到0.2，使用六个500ml离心管（7,000×g; 5分钟， C）。用少量培养物重悬细胞沉淀上清液，从500-ml离心管转移到6个15-ml 收集样品管和沉淀（3500xg，5分钟，4℃）。的细胞沉淀物通过液体N 2 2冷冻
4. 将每个细胞沉淀悬浮于在冰上预冷的3.5ml缓冲液I中
5. 使用French压机（8,000p.s.i.）破碎细胞，使样品通过三次。
6. 通过离心（11,000×g，30分钟，4℃）除去细胞碎片。
7. 将上清液（细胞裂解物）以30,000×g离心30分钟 min，在4℃下，例如在HITACHI P55ST2转子中以18,000rpm
8. 将所得上清液（S30上清液）以200,000×离心在HITACHI P55ST2转子中以45,000rpm在4℃下（例如）进行100分钟。
9. 每个沉淀用200μl缓冲液I重悬浮悬浮液保存在-80℃直至需要（S100沉淀部分）。
  请注意，S100馏分可以看作是底部的琥珀色沉淀管。使用玻璃棒可优选重悬沉淀因为通过移液的颗粒的再悬浮不容易。
  注意：注意避免在重悬沉淀时产生泡沫。
70S核糖体的纯化
1. 为了进一步纯化70S核糖体，制备10-40％蔗糖梯度在SW28离心管中使用梯度Master梯度混合器
2. 在缓冲液I中制备10％和40％蔗糖溶液
3. 使用Gradient Master梯度混合器在SW28离心管中产生10至40％蔗糖梯度
4. 将S100丸粒部分施用在10至40％蔗糖梯度，并在4℃下以67,000×g离心17小时（例如， HITACHI P28S转子以22,500rpm，每个离心机使用270A 260个单位管）
5. 通过活塞梯度分馏器和微收集器。使用a。测定260nm处的吸光度分布 Nano drop 2000.
  注意：粗细胞提取物的核糖体图谱的一个实例如图1所示。
6. 收集含有70S核糖体的级分被鉴定为在260nm处具有吸光度的峰
7. 从合并的级分回收核糖体用缓冲液I（1:2稀释）稀释，并以64,000×g离心在4℃下17小时。（例如在HITACHI P40ST转子上，转速为22,500 rpm）。
8. 从离心管中完全除去上清液
9. 所得的70S核糖体沉淀用300μl的包被缓冲液I并在4℃下放置过夜。然后轻轻地沉淀沉淀使用玻璃棒重悬浮于缓冲液I中并储存在-80℃直至必需。
  注意：注意避免在重悬沉淀时产生泡沫。

代表数据

图1.通过10-40％蔗糖梯度沉降从粗细胞提取物得到的核糖体图谱。从对数期细胞（OD 600 = 0.2）制备的粗细胞提取物将野生型菌株（168μgtrpC2）应用于10至40％蔗糖梯度的顶部，并在4℃下以55,000×g离心17.5小时（例如在HITACHI P40ST转子中以21,000rpm，每个离心管使用10安培260单位）。 A 260nm测量显示为A 420测量的相同的图谱，并且可以确定70S核糖体的峰。当S100馏分经受10至40％蔗糖梯度和离心时，未观察到小于30S的峰。

食谱

LB培养基
0.5％NaCl
1％胰蛋白酶
0.5％酵母提取物
1.5％琼脂（仅用于平板）
缓冲液I（200ml就足够了，在冰上预冷）

20 mM
Tris-HCl（pH 7.6）

15 mM
乙酸镁

100 mM
乙酸铵

0.1 mM
DTT

2 mM
PMSF

缓冲液I用DEPC处理的水制备注意：缓冲区I可以在没有DTT和PMSF的情况下存储。 DTT和PMSF在使用前加入缓冲液中。缓冲液I应在整个程序中预冷。
10-40％蔗糖溶液在缓冲液I中制备10-40％蔗糖溶液

确认

该协议改编自Nanamiya等人（2004）和Suzuki等人（2014）。这项工作得到日本教育，文化，体育，科学和技术部的科学研究助理（C）（G.A.）的部分支持。

参考文献

Nanamiya，H.，Akanuma，G.，Natori，Y.，Murayama，R.，Kosono，S.，Kudo，T.，Kobayashi，K.，Ogasawara，N.，Park，SM，Ochi，K.and Kawamura ，F。（2004）。锌是控制枯草芽孢杆菌中两种类型L31蛋白交替的关键因素核糖体。 Mol Microbiol 52（1）：273-283。
Nanamiya，H.，Kawamura，F.and Kosono，S。（2006）。枯草芽孢杆菌核糖体的蛋白质组学研究：锌依赖性替代的发现对于核糖体蛋白L31旁系同源物。 J Gen Appl Microbiol 52（5）：249-258。
Natori，Y.，Nanamiya，H.，Akanuma，G.，Kosono，S.，Kudo，T.，Ochi，K.and Kawamura，F。（2007）。在锌限制性条件下在枯草芽孢杆菌中的核糖体的故障安全系统 Mol Microbiol 63（1）：294-307。
Suzuki，S。，Tanigawa，O.，Akanuma，G.，Nanamiya，H.，Kawamura，F.，Tagami，K.，Nomura，N.，Kawabata，T.and Sekine，增强的枯草芽孢杆菌 yaaA可以恢复由编码核糖体蛋白L2的rplB突变引起的生长和孢子形成缺陷。 160（Pt 6）：1040-
Tagami，K.，Nanamiya，H.，Kazo，Y.，Maehashi，M.，Suzuki，S。，Namba，E.，Hoshiya，M.，Hanai，R.，Tozawa，Y.，Morimoto， Ogasawara，N.，Kageyama，Y.，Ara，K.，Ozaki，K.，Yoshida，M.，Kuroiwa，H.，Kuroiwa，T.，Ohashi，Y.and Kawamura，在（p）ppGpp（0）中表达小（p）ppGpp合成酶YwaC，突变体触发核糖体的YvyD依赖性二聚化。 1（2）：115-134。