材料和试剂

Dauer幼虫
SU-8光致抗蚀剂2008（MicroChem Corp）
聚二甲基硅氧烷（PDMS）（Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit，Dow-Corning）
琼脂粉（OCI Company Ltd，目录号：9002-18-0）
棉纱布
M9解决方案（参见配方）
合成信息素板（见配方）

设备

微波炉或高压锅
解剖显微镜（Leica Microsystems，型号：S6E）
带玻璃毛细管（Chase）的嘴移液器
60Φ培养皿（SPL Life Sciences，型号：10060）
幻灯片（Marienfeld）
小铲
玻璃瓶
孵育器（Vision Scientific Co.Ltd。，型号：VS-8480S）

程序

准备用于监听测试的dauers
1. 可以通过多种方法诱导Dauer。最容易，dauer可以从饥饿板制备。也可以通过治疗诱导多柔比星粗信息素（Golden and Riddle，1984）。我们通常使用合成信息素板诱导dauers，那些dauers似乎给了更多可重复的数据比饥饿诱导的dauers。 Dauers 温度敏感的dauer形成组成型突变体可以很容易温度漂移引起的。我们通常让成虫蠕虫产卵 15℃，然后将温度变为25℃
纱布测试
1. 计算待测板中的总持续时间。
2. 切割棉花医用纱布适合大小的培养皿，并把它。 Dauers 在5分钟内观察到在灯丝上的波动
3. 计数数目的持续挥动或站在纱布的时刻3次。睡眠比可以测量为[平均睡眠次数 dauers /总持有人数]。
  
  视频1.纱布测试
微尘芯片制造
1. 通过图案化孔阵列制造微污垢母版 μm（半径）×25μm（高度）×25μm（距离）]到4英寸硅上晶片通过使用SU-8的光刻法。主副本的副本通过将10ml PDMS预聚物倒入母板上并固化来制备聚合物在65℃下30分钟（Xia和Whitesides，1998）。固化聚合物层从母板上剥离并切割以适合60Φ 培养皿。 PDMS阴性复制品作为微污垢的模具芯片。用D.W.制备琼脂溶液（3.5％〜4％）。通过用微波煮沸或高压釜。冷却至约70℃，并将琼脂溶液倒入 PDMS模具放置在结构侧向上的60Φ培养皿中
2. 在之前用载玻片除去PDMS模具表面上的气泡琼脂溶液固化。优化琼脂浓度考虑琼脂粉的质量和琼脂溶液的刚度。如果解决方案太硬，阻碍气泡去除。如果除去气泡，等待直到琼脂溶液完全固化
3. 使用刮刀，取出固化部分（PDMS模具+微尘片）培养皿，并从其分离PDMS模具。剩余的琼脂部分微污垢芯片与正阵列的柱
4. 在37℃培养箱（无振荡）中干燥微污垢芯片1.5小时，然后使用。
微污渍芯片测试
1. 收集30 ⁺ dauers与M9加载口吸管，并释放他们中心的微污垢芯片在解剖显微镜下。需要10〜30 min，用于在转移到微尘屑片之后开始运动室温。
2. 只有持久的人才能在微尘片上。当dauer抬起他们的脖子，我们认为点作为开始。当它的身体落回到表面，我们认为它的完成 nictation。
3. 对于单独的诊断测定，观察每个移动 dauer 1分钟并测量摄取时间。休息室（包括站立的dauers）从测试中排除。从这些原始数据，nictation 比率，起始指数和平均持续时间到Lee 等人（2011）。
4. 对于群体诊断测定，扫描微污垢芯片（通过眼睛），同时计数数量的嘲笑dauers和爬行动物（图1）。只有移动（爬行和捕食）应计算。起始索引和平均持续时间不能从群体测定中提取
  
  图1.微污垢芯片微粒子芯片的表面被扫描眼睛计数移动的dauers和nictation dauers的数量。不包括休息室。情绪比可以测量为在移动dauers之间的分数。我们测量3次相同的微尘片和平均结果。对于每个菌株，我们通常使5 +独立的重复，以获得可重复的陈述比率
  
  视频2.微尘芯片制造和测试

笔记

记忆测定结果表现出相当大的日常变化，并且随机结果的原因是未知的。为了克服可变性和重现性的问题，建议进行多次独立的重复，而不是一次测试多个蠕虫。例如，通过单独测定，N 1 2可以显示出来自一个测试（N> = 10）的从10％至70％的记忆比，但是可以获得从约20％至40％的稳定的平均记忆比多重测试。
在诊断测定中，我们仅测量移动停止。对于个体诊断测定，一个挥动的蠕虫可以突然静止，然后我们从结果中排除该蠕虫。然而，我们也计数捕食蠕虫，可能在人口测定中停止一会儿。推测，这种差异使得群体测定产生比单独测定稍高的记忆率

食谱

M9缓冲区
3g KH sub 2 PO 4 sub
6g Na 2 HPO 4
5克NaCl
1ml 1M MgSO 4 H sub 2 O到1L
高压灭菌
灭菌
合成信息素板
1.5g KH 2 PO 4 sub/
0.25g K 2 HPO 4
1克NaCl
10g琼脂
（或者，5g琼脂+ 3.5g琼脂糖用于挖掘如em 或 npr-1 突变体的菌株） 4 mg胆固醇（高压灭菌后加入）

致谢

这项工作是通过国家研究基金会（NRF）（NRF-2014R1A4A1005259，NRF-2013K2A3A1000102和NRF-2013R1A2A1A03070982）的研究拨款支持。 D. L.由TJ公园科学奖从POSCO TJ公园基金会支持。该协议已经从我们之前的工作（Lee等人，2012年）修改和修改。

参考文献

Golden，J.W.and Riddle，D.L。（1984）。 Caenorhabditis elegans dauer诱导信息素和食物供应的拮抗成分。 J Chem Ecol 10，1265-1280。
Lee，H.，Choi，M.K.，Lee，D.，Kim，H.S.Hwang，H.，Kim，H.，Park，S.，Paik，Y.K.and Lee，定义，线虫的线虫的分散行为，受制于 IL2 neurons。 Nat Neurosci 15（1）：107-112。
Xia，Y。和Whitesides，G.M。（1998）。软光刻。 Angew Chem Int Edn Engl 28（1）：153-184。