材料和试剂

乙酸（CH 3 COOH）（Panreac Applichem）
丙酮[（CH 3）2 CO]（Panreac Applichem）
ApoAlert DNA片段化测定试剂盒（Clontech，目录号：630107）
（3-氨基丙基）三乙氧基硅烷（APTES）（C 9 H 23 NO 3 Si）（Sigma-Aldrich，目录号：440140 ）
Cellulase Onozuka RS（Duchefa Biochemie，目录号：C8003）
Citifluor固体填充剂试剂盒（Agar Scientific，目录号：AGR1326）
清除指甲油
去离子H 2 O（Milli-Q H 2 O）
蒸馏水
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4）（Duchefa Biochemie）
乙二胺四乙酸（EDTA）（C 10 H 16 N 12 O 18）（Duchefa Biochemie）
乙醇（C 2 H 5 OH）（Panreac Applichem）
甲醛（HCHO）（36.5-38％）（Panreac Applichem，目录号：48131328）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Duchefa Biochemie）
石蜡（Panreac Applichem，目录号：253211）
多聚甲醛[（HCHO）n]（Panreac Applichem，目录号：141451）
氯化钾（KCl）（Duchefa Biochemie）
碘化丙啶（PI）（Sigma-Aldrich，目录号：P4864）
蛋白酶K（Sigma-Aldrich，目录号：P4850）
重组DNA酶I（不含RNase）（TAKARA BIO，目录号：2270A）
氯化钠（NaCl）（Duchefa Biochemie）
氢氧化钠（NaOH）（Panreac Applichem）
硫酸（H 2 SO 4）（Sigma-Aldrich）
叔丁醇/2-甲基-2-丙醇（TBA）[（CH 3 3）3 COH]（Panreac Applichem，目录号：141903）
三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）[NH 2 CH（CH 2 OH）3·HCl]（Duchefa Biochemie） br />
Triton X-100（Sigma-Aldrich）
二甲苯[C 6 H 4（CH 3）2]（Panreac Applichem）
固定解决方案（参见配方）
TBA解决方案（参见配方）
TBA：石蜡（见配方）
配方水（见配方）
APTES涂层幻灯片（见配方）
1x PBS缓冲液（见配方）
4％甲醛的1x PBS缓冲液（见配方）
2％纤维素酶Onozuka在1x PBS缓冲液中（参见配方）
0.5％Triton X-100的1x PBS缓冲液（参见配方）
Tris-HCl（参见配方）
EDTA（见配方）
100 mM Tris-HCl（参见配方）
蛋白酶K溶液（见配方）
1x DNA酶I缓冲液（见配方）
1,500 U/ml DNase I（参见配方）
PI解决方案（参见配方）
抗褪色试剂（见配方）

设备

15 ml管
100 ml变黑的瓶子
100毫升变黑的玻璃瓶
100ml玻璃烧瓶中
200 ml玻璃Coplin罐
250毫升玻璃罐
高压灭菌器
过滤器无菌Filtropur S 0.2（SARSTEDT AG）
平面（墙砖）
镊子
通风橱
玻璃盖片
玻璃盖托盘
实验室炉
Leica TCS-SP2共焦显微镜
用于石蜡块制备的Leuckart棒（ICT，SL。，目录号：10120996051645）
带加热板的磁力搅拌器
切片机（涩谷光学）
切片机刀片Accu-Edge ^®低调（樱花）
油漆刷
pH计
无菌刀片的手术刀
幻灯片

软件

LCS软件用于Leica TCS-SP2共聚焦显微镜

程序

花卉收集
我们从猕猴桃的成熟雌性葡萄树中收集花，猕猴桃猕猴桃 var deliciosa （A.Chev。）A.Chev。 'Hayward'生长在位于西班牙西北部（加利西亚）的商业果园，由KiwiAtlánticoS.A公司经营。
1. 通过使用手术刀分离瓣，萼片和雄蕊，在收集后立即准备植物材料。
  
  图1.植物材料。A.猕猴桃雌花。 B.雌性雌蕊（具有耻骨臂的卵巢124）。 C.一个女性耻辱手臂脱离雌蕊。
2. 淹没完全五雌蕊（卵巢和支链臂）在含有60ml固定溶液的100ml玻璃烧瓶中在4℃下培养24小时（William等人，1999）。
3. 取出固定溶液，加入60 ml 75％乙醇。储存于4°C直至使用。
石蜡包埋的胳膊
1. 将5个耻骨臂，每个从不同的花，在15毫升管中。
2. 向样品中加入5 ml TBA V（食谱II）溶液，并在室温下孵育3小时。
3. 取出TBA V，加入5毫升TBA IV的样品，并在室温下孵育过夜。
4. 除去TBA IV，向样品中加入5 ml TBA III，并在室温下孵育70分钟。
5. 除去TBA III，向样品中加入5ml TBA II，并在室温下温育80分钟。
6. 除去TBA II，向样品中加入5毫升TBA I，并在室温下孵育100分钟。
7. 除去TBA I，向样品中加入5ml纯TBA，并在38℃下在实验室烘箱中孵育85分钟。
8. 用新鲜TBA替换TBA，并在38℃下在实验室烘箱中孵育45分钟。
9. 用新鲜TBA替换TBA，并在38℃下在实验室烘箱中孵育过夜。
10. 取出TBA，加入5 ml TBA：石蜡（以前保持在60℃） ℃，在实验室烘箱中）并在60℃在a中孵育24小时实验室烤箱。
11. 替换TBA：将石蜡与新鲜的石蜡一起在实验室烘箱中在60℃下孵育24小时。
12. 去除TBA：石蜡加入5毫升石蜡（以前保持在60℃），并在60℃下在实验室中孵育7小时烤箱。
13. 用新鲜石蜡替换石蜡，并在60℃下在实验室烘箱中孵育5天。
14. 把一薄层液体石蜡放入Leuckart酒吧。放置样品在石蜡固化之前排列成水平位置并完全覆盖额外的液体石蜡。每个两个样本模具可以制备。允许固化至少3-4小时。
15. 标记石蜡块，指示耻性臂取向，并将其存储在室温直到使用。
剖面准备
1. 在手术刀的帮助下修整石蜡块以获得最佳包括具有小石蜡框架的样品的切割表面
2. 将小石蜡框架固定在切片机卡盘上。
3. 设置切片机刀片并调整刀片和样品的位置。
4. 切割石蜡块以获得10μm厚部分的带包含连续分段的耻骨臂。拿起部分镊子或油漆刷，并将它们存储在玻璃盖的托盘中。
5. 将几滴配制的水放在先前制备的APTES涂覆的载玻片的表面上。
6. 从托盘中取出含有耻骨臂样品的切片在镊子的帮助下，将它们放在配方的表面上水涂覆在APTES涂覆的载玻片上（每个载玻片约15-18个切片）。
7. 在30°C下在实验室烘箱中放置切片过夜以允许薄的部分膨胀并完全附接到载玻片。
8. 在室温下存储载玻片。
用于微观检测的样品制备
该程序使用ApoAlert DNA片段化测定试剂盒进行。我们通常在每个协议会话中同时处理四个幻灯片。从他们，两个幻灯片包含实验样本，其他两个是控件，一个负和另一个正。对于后面的（阳性对照），必须使用专用的实验室材料（玻璃杯子，墙砖，镊子，等）。
从2到11，以及从26到29的步骤遵循ApoAlert DNA片段化测定试剂盒协议（分别为步骤1-10和12-14）。
1. 在实验室烘箱中在60℃下孵育载玻片7分钟，以确保完全去除石蜡
2. 通过将载玻片浸入含有新鲜二甲苯的Coplin瓶中来除去石蜡。在室温下孵育5分钟。
3. 重复一次第二步，将幻灯片转移到包含新鲜二甲苯的新Coplin罐
4. 将玻片浸没在含有新鲜100％乙醇的Coplin罐中，并在室温下孵育5分钟。
5. 通过顺序孵育它们3分钟的步骤，再水合幻灯片在室温下在不同的Coplin罐中包含：100％乙醇 95％乙醇85％乙醇70％乙醇50％乙醇
6. 将载玻片浸没在含有新鲜的0.85％NaCl（p/v）的Coplin罐中，并在室温下孵育5分钟。
7. 将载玻片浸入含有新鲜1x PBS缓冲液的Coplin罐中，并在室温下孵育5分钟。
8. 固定幻灯片通过将它们浸泡在Coplin瓶子含有新鲜的4％甲醛，并在室温下孵育15分钟。
  注意：让纤维素酶在冰上融化以在步骤12中使用。
9. 通过将载玻片浸入含有1×PBS缓冲液的Coplin瓶中来洗涤载玻片，并在室温下孵育5分钟。
10. 将载玻片转移到另一个含有1x PBS缓冲液的Coplin罐中，并在室温下再次孵育5分钟。
11. 让液体彻底排空，将幻灯片放在平面上表面（墙砖）。纤维素酶，Triton X-100和蛋白酶K. 治疗必须小心进行，由于损失部分的风险，其可以从载玻片滑落。
12. 覆盖每个部分 2％纤维素酶Onozuka RS。解决方案必须完全覆盖部分。通常这可以用1ml溶液/载玻片进行。
13. 用倒置的Coplin瓶盖覆盖载玻片，底部带有湿纸巾，以确保高湿度（图2）。
  
  图2.倒置的Coplin罐中含有湿纸巾底部保证高湿度，在实验室烘箱孵化幻灯片
14. 在实验室烘箱中在37℃孵育90分钟。
  注意：在1x PBS缓冲液中制备0.5％Triton X-100用于步骤18.
15. 将纤维素酶处理的载玻片浸渍在含有1x的Coplin瓶中 PBS缓冲液中，并在室温下孵育5分钟。
16. 重复两次步骤15使用一个新的Coplin罐，含有新鲜的1×PBS缓冲液。
17. 让液体彻底排空，将幻灯片放在墙上的瓷砖上。
18. 用0.5％Triton X-100在1×PBS缓冲液中覆盖每个切片。解决方案必须完全覆盖部分。通常这可以做到每个载玻片1ml溶液。
19. 在室温下孵育20分钟。
  注意：准备在步骤23中使用的20μg/ml蛋白酶K溶液。
20. 将Triton X-100处理的载玻片浸入Coplin罐中 1×PBS缓冲液，并在室温下孵育5分钟。
21. 重复两次步骤20使用一个新的Coplin罐，含有新鲜的1×PBS缓冲液。
22. 让液体彻底排空，将幻灯片放在墙上的瓷砖上。
23. 用20μg/ml蛋白酶K覆盖每个切片完全覆盖部分。通常这可以用1ml的解决方案。
24. 用倒置的Coplin瓶盖覆盖载玻片，底部带有湿纸巾，以确保高湿度（图2）。
25. 在实验室烘箱中在37℃孵育30分钟
26. 将Triton X-100处理的载玻片浸入Coplin罐中 1×PBS缓冲液，并在室温下孵育5分钟
27. 将幻灯片浸没在含有4％甲醛的Coplin罐中，并在室温下孵育5分钟
28. 重复步骤26，使用含有新鲜1x PBS缓冲液的新Coplin罐
29. 将载玻片置于新鲜的1×PBS缓冲液中，除了用于制备阳性对照
30. 准备阳性对照（用DNase）取幻灯片包含为它选择的部分，并保持它分开其他载玻片（实验样品和阴性对照）点。有必要使用专用的实验室材料（Coplin 罐，镊子，墙砖，等）。
  1. 让液体彻底排空，将幻灯片放在墙上的瓷砖上。
  2. 加入1x DNA酶I缓冲液。解决方案必须完全覆盖部分。通常这可以用100μl的溶液完成。
  3. 孵育玻片在室温下5分钟。

通过显微镜检查（使用ApoAlert DNA片段化测定试剂盒）进行TUNEL检测的染色
使用所有样品（实验，阴性和阳性样品）使用ApoAlert DNA片段化测定试剂盒进行该程序。记住要保持阳性对照与其他幻灯片分开。从1到12的步骤遵循ApoAlert ^® DNA Fragmentation Assay Kit协议（步骤1-5,7-9,11-16）。

从1x PBS缓冲液中取出载玻片，轻轻轻轻取出多余的液体; 将幻灯片放在墙砖上
使用微量移液管用100μl平衡缓冲液覆盖载玻片。
使用镊子，轻轻地放置一片塑料盖玻片在幻灯片的顶部，以均匀地分布液体。

在室温下平衡10分钟。解冻核苷酸混合冰并为所有样品和对照制备TdT孵育缓冲液。保护核苷酸混合物和TdT孵育缓冲液从光。保持在冰上每时每刻。染色后保护载玻片免受光照。
使用下表（或类似的表）来准备实验样品和阳性对照：

组件	卷	总反应数	总量
平衡缓冲器	45微升	没有^o fslides + 1	X微博
核苷酸混合物	5微升	没有^o fslides + 1	X微博
TdT酶总量	1微升	没有^o fslides + 1	X微博
总计	51微升	没有^o fslides + 1	X微博

使用下表（或类似）来准备负控制：

组件	卷	总反应数	总量
平衡缓冲器	45微升	1	X微博
核苷酸混合物	5微升	1	X微博
Milli-Q H sub 2 O 2/	1微升	1	X微博
总计	51微升	1	X微博

使用镊子，取下塑料盖玻片，轻轻点击滑动以除去多余的液体。由于丢失的风险小心管理部分。用棉纸小心地擦干边缘将幻灯片放在墙上的瓷砖上。
用微量移液管轻轻地放置50微升TdT培养缓冲液在载玻片上。
使用镊子，轻轻地放置一块塑料盖玻片在幻灯片的顶部，以均匀地分布液体
为了进行拖尾反应，将载玻片置于37℃的黑暗中在实验室烘箱中60分钟。倒置覆盖幻灯片 Coplin罐包含湿纸巾在底部，以确保高湿度，并通过用铝箔覆盖保持在黑暗中
使用镊子，删除塑料盖玻片。由于丢失部分的风险，请小心管理。
通过将幻灯片浸入Coplin来终止拖尾反应瓶子含有2x SSC缓冲液。在室温下孵育15分钟
通过将载玻片浸入含有1x PBS缓冲液的新鲜Coplin瓶中来洗涤载玻片。在室温下孵育5分钟
重复两次步骤11使用一个新的Coplin罐，含有新鲜的1×PBS缓冲液注意：准备在第14步中使用的0.5μg/ml PI。
让液体彻底排空，将幻灯片放在墙上的瓷砖上。
用0.5μg/ml PI覆盖每个切片。解决方案必须完全覆盖部分。通常这可以用1ml溶液每次进行滑动。
在室温下孵育5分钟。
洗通过将载玻片转移到含有新鲜Coplin罐的组织 Milli-Q H 2 O并在室温下孵育5分钟。
重复步骤16两次。
注意：准备在步骤19中使用的防褪色试剂。
让液体彻底排空，将幻灯片放在墙上的瓷砖上。
每个幻灯片添加150微升的抗褪色试剂，并盖住处理包含具有玻璃盖片的部分的载片的部分。
用清晰的指甲油密封盖玻片的边缘，并允许干燥至少5-10分钟。样品可以立即检查或在4℃下在黑暗中储存过夜，仅供下次观察天。我们通常在Leica TCS-SP2共焦显微镜中检查切片。通过在自由处并入荧光素-dUTP产生荧光使用激发来检测片段化DNA的3'-羟基末端波长为488nm的TUNEL反应和561nm的PI，与在492-550nm和581-625nm的范围内分别检测。

代表数据

用于猕猴桃组织中DNA断裂的TUNEL测定的这种改进方案依赖于通过用纤维素酶，Triton X-100和调整的蛋白酶K处理来改善组织的透化作用，用于产生的DNA酶I单位（1,500U/ml）增加的阳性对照，以及使用降低的IP浓度（0.5μg/ml）的复染的优化。这些修饰允许我们清楚地显示TUNEL的阴性和阳性细胞核之间的差异（图3A-C），与使用ApoAlert DNA片段化测定试剂盒的原始方案获得的结果相反，不是为植物组织特异设计的（图3D-F）。在图3A中，可观察到TUNEL阳性细胞核，因为它们显示亮绿色荧光，而在图3B中，所有存在的细胞核染成红色。最后，在图3C中，可以观察到所有存在的核，但是TUNEL阳性的那些染色为黄色，而那些TUNEL阴性的染色为浅红色或橙色。相反，使用ApoAlert 试剂盒（图3D-F），因为没有观察到TUNEL阳性细胞核（图3D），所有存在的细胞核可以以红色观察到（图3E）橙色复染色（图3F）。

图3.猕猴桃组织的阳性对照中TUNEL测定的比较。 A-C。使用本文描述的改进的TUNEL方案染色猕猴桃耻辱臂的阳性对照切片。 D-F。阳性对照使用ApoAlert DNA片段化测定试剂盒（Clontech）染色猕猴桃耻辱臂的切片。 A，D。在488nm检测到的荧光用于观察TUNEL染色的细胞核（箭头）。 B，E。在561nm处检测荧光以观察IP染色的核（箭头）。 C，F。通过用TUNEL和IP（箭头）对染色的核的两个波长（488和561nm）的同时荧光检测进行计数染色。

食谱

固定溶液（100ml）
乙醇：乙酸（3:1，v/v）洗脱将75ml无水乙醇与25ml乙酸混合

TBA溶液（100ml）

TBA I
纯TBA	75 ml
96％乙醇	25 ml
TBA II
TBA I	73.2 ml
96％乙醇	26.8 ml
TBA III
TBA II	63.6毫升
96％乙醇	21.4 ml
H sub 2 O	15 ml
TBA IV
TBA III	57 ml
96％乙醇	21.6 ml
H sub 2 O	21.4 ml
TBA V
TBA IV	50 ml
96％乙醇	15 ml
H sub 2 O	35 ml

TBA可在室温下固化
如果发生这种情况，请在实验室烘箱中在38℃下加温
在室温下储存在100 ml黑色玻璃瓶中，直到使用

TBA：石蜡（3:1v/v）（100ml）将25ml液体石蜡与75ml纯TBA混合石蜡应在60℃下
混合应使用液体
在室温下储存在250 ml玻璃瓶中，直到使用
配方水（100ml）
将3ml甲醛36.5-38％与97ml蒸馏水
混合
APTES涂层载玻片
制备在丙酮（v/v）中的2％APTES 将玻片在室温下在2％APTES中浸泡3分钟
将载玻片在丙酮中室温浸泡2分钟，
重复两次
将载玻片在蒸馏水中在室温下浸泡1分钟，
允许风干（至少24小时）
储存在室温下直到使用
1×PBS缓冲液（pH7.4,1L） 10x PBS缓冲液（pH7.4,1L）

NaCl
80克
137 mM

KCl
2.2 g
3 mM

Na HPO ₄
14.4克
10 mM

KH ₂ PO ₄
2.4克
2 mM

将试剂溶解在800ml Milli-Q H 2 O中调整pH值
将音量调整为1 L
高压灭菌器
合并100ml 10x PBS缓冲液和900ml Milli-Q H 2 O
4％甲醛的1×PBS缓冲液（pH7.4,1L）中在通风橱下将40g多聚甲醛溶于500ml 1×PBS缓冲液中在70℃下搅拌的同时加热溶液
加入一滴或两滴硫酸以促进多聚甲醛稀释
将音量调整为1 L
储存在100 ml黑色瓶中，在4°C下最长1-2周，或在-20°C下无限期保存
2％纤维素酶Onozuka的1×PBS缓冲液（10ml）中将0.2g纤维素酶溶解在6ml 1×PBS缓冲液中
在4℃缓慢搅拌过夜孵育
完成体积为10ml，过滤灭菌（0.2μm）
储存于-20°C直到使用
0.5％Triton X-100的1x PBS缓冲液（10ml）中将50μlTriton X-100溶于9.95 ml 1×PBS缓冲液中
使用新鲜制备的溶液
Tris-HCl（0.5M，pH8.0）（100ml）将7.87g Tris-HCl溶于100ml蒸馏水中用NaOH调节pH值
高压灭菌并在室温下贮存
EDTA（0.2M，pH8.0）（100ml）将5.84g EDTA溶解在100ml蒸馏水中用NaOH调节pH值
高压灭菌并在室温下贮存
100mM Tris-HCl（pH8.0），50mM EDTA（3ml）将2ml Tris-HCl缓冲液（0.5M，pH8.0）与1ml EDTA（0.2M，pH8.0）结合
蛋白酶K溶液（20μg/ml）（1ml）将2μl的10mg/ml蛋白酶K与998μl的100mM Tris-HCl（pH8.0），50mM EDTA组合
1×DNase I缓冲液（100μl）
用90μlMilli-Q H 2 O稀释10μl10x DNA酶I缓冲液
1,500 U/ml DNA酶I（75μl）
合并45μlMilli-Q H Sub 2 O，22.5μl重组DNA酶I和7.5μl10×DNA酶I缓冲液
PI溶液（0.5μg/ml，在PBS缓冲液中）（5ml）库存：1mg/ml PI：将10mg PI溶解在10ml 1x PBS缓冲液中
将原料在4℃下储存在黑暗中
0.5μg/ml PI溶液：2.5μl原液和5ml 1x PBS缓冲液
抗褪色试剂（1ml）
合并900μlPVA溶液（Citifluor固体填充试剂盒）和100μlAF100（Citifluor固体填充试剂盒）

致谢

这项研究由Xunta de Galicia（西班牙加利西亚地区政府;项目PGIDIT 04RAG291002PR）支持。我们感谢KiwiAtlánticoS.A.提供植物材料。我们感谢科罗拉多州的专家摄影协助，和B. Lueiro的技术援助。这是国际大学研究小组在木本植物的生物技术和生殖生物学（BioVitAc研究组，代码09IDI1705）的贡献。

参考文献

ApoAlert DNA Fragmentation Assay Kit用户手册（Clontech，目录号：630107）
Ferradas，Y.，Lopez，M.，Rey，M.and Gonzalez，M.V。（2014）。猕猴桃耻辱臂中的程序性细胞死亡及其与有效传粉期和程序性阶段的关系。/a> Ann Bot 114（1）：35-45
原位细胞死亡检测试剂盒，荧光素（Roche Diagnostics，目录号：11 684 795 910）
Williams，J.H.，Jr.，Friedman，W.E.and Arnold，M.L。（1999）。被子植物风格中的发育选择：使用配子DNA可视化种间花粉竞争。 Proc Natl Acad Sci USA 96（16）：9201-9206。