材料和试剂

Huh7.5细胞
含有复制型HCV复制子RNA（=复制子细胞）的Huh7.5细胞（Vogt等人，2013）
Dulbecco改良的Eagle培养基（含有4.5g/L葡萄糖，L-谷氨酰胺和丙酮酸钠）（DMEM）（Corning Cellgro，目录号：10-013-CV）
胎牛血清（FBS）（Benchmark，目录号：100-106）
青霉素/链霉素溶液100x（Pen/Strep）（Corning Cellgro，目录号：30-002-Cl）
L-谷氨酰胺（Corning Cellgro，目录号：25-005-CI）
G418硫酸盐（Corning Cellgro，目录号：25-052-CI）
没有Ca 2+和Mg 2+ 2+（PBS）（Corning Cellgro，目录号：21-031-CV）的Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水
胰蛋白酶/EDTA（Corning Cellgro，目录号：25-052-CI）
蛋白酶抑制剂混合物（Sigma-Aldrich，目录号：P8340）（以1:100稀释度使用）
台盼蓝染料（Gibco，目录号：15250-061）
BioRad蛋白测定（Bio-Rad Laboratories，目录号：500-0006）
Brilliant Blue G-250（Thermo Fisher Scientific，目录号：100-25）
碘克沙醇（60％）（Sigma-Aldrich，目录号：D1566-250ML）（保持在4℃用于实验中）
PBS /蔗糖（见配方）
20％iodixanol（见配方）
10％iodixanol（见配方）
2x Laemmli缓冲区（参见配方）

设备

超清离心管（Beckman Coulter，目录号：344059）
37℃5％CO 2细胞培养孵育器
P1000移液器
显微镜
血细胞计数器
紧配合杜松匀浆器（7ml）（Wheaton，目录号：357542）
离心机（Beckman Coulter，型号：Allegra 6R）
分光光度计
超速离心机（Beckman Coulter，型号：Optima L-80 XP，带SW41T转子）
蛋白电泳仪
Western印迹仪

程序

Huh7.5或HCV复制子细胞在补充有10％FBS，1x Pen/Strep，1×谷氨酰胺的DMEM中生长4-5天，在T175烧瓶中从20％至80％最终融合（每种细胞类型需要5个烧瓶）。用于HCV复制子细胞的培养基另外补充有800μg/ml G418
通过用10ml PBS（加入PBS至烧瓶，手动搅拌2-3次并抽出PBS）洗涤一次，然后用每个T175烧瓶中的4ml胰蛋白酶胰蛋白酶消化细胞（在37℃下用胰蛋白酶孵育细胞，用于3-5分钟，通过洗涤烧瓶壁并转移到50ml锥形管中，用6ml PBS取出细胞）。将细胞以400×g离心5分钟，吸出上清液，通过将细胞重悬浮于PBS中，用30ml PBS洗涤细胞一次，并在400rpm下再次离心5分钟， xg，然后重悬于10ml PBS中，并在血细胞计数器中计数。将每个样品的总共3×10 7个细胞重悬于3.5ml预冷的PBS /蔗糖加蛋白酶抑制剂混合物（1:100稀释）中，立即储存在冰上。
在紧密配合的dounce匀浆器中将细胞裂解200次，同时将匀浆器保持在冰上。
注意：小心不要将杵提起在裂解液表面以上，以尽量减少气泡的产生。
通过混合10微升的溶胞产物与10微升台盼蓝染色，然后检查样品在显微镜检查细胞超过90％裂解。死细胞会染成蓝色。如果没有足够的细胞裂解，在dounce匀浆器中额外传代裂解细胞，并检查每50次传代细胞裂解是成功的。
将细胞裂解物在4℃下以2,500xg离心10分钟以沉淀细胞碎片和细胞核。
将上清液（称为粗裂解物）转移到新管中并保持在冰上。
使用Bio-Rad蛋白测定根据制造商的方案测量粗裂解物中的总蛋白浓度
每个样品取5毫克蛋白质，加入PBS /蔗糖至总体积为2毫升。将2×Laemmli缓冲液以1：1混合的剩余粗裂解物冻结作为对照
将2ml样品与2ml 60％碘克沙醇（在4℃预冷）1:1混合，得到4ml终浓度为30％碘克沙醇的样品。
将4毫升30％iodixanol /裂解液混合物放在离心管的底部。小心地用4ml 20％碘克沙醇（预冷冻）覆盖，然后用4ml 10％碘克沙醇（预冷冻）覆盖。然后用10％填充管，直到水平达到离心管边缘以下1mm。（用P1000移液管通过切下1cm的移液管吸头覆盖，然后慢慢地移取1ml，立即在离心管中间的梯度水平的顶部缓慢移动，以使混合最小化。）确保管平衡孔离心，如果需要，小心地添加10％的碘克沙醇到平衡管
在SW41T转子中于4℃下以209,000×g（35,000rpm）旋转过夜（16小时）。
第二天：从顶部到底部收集22个级分（500μl）。使用切断P1000的移液器吸头，并从中间小心取出500微升，只是触摸移液器的尖端到梯度的表面，然后缓慢下降尖端保持在梯度的表面，同时脱离样品非常缓慢。移液管尖端的增加的宽度减小了漩涡效应并且使梯度层的混合最小化。
混合级分1：1与2x Laemmli缓冲液，并冷冻，优选等分，在-80℃。
然后可以通过SDS-PAGE和Western印迹分析样品[参见Vogt等人（2013）的结果]。

笔记

该协议也可以应用于其他细胞系。末端部分之间的分布可以根据细胞系而变化。具有非常低脂质含量的细胞系可能不如Huh7.5那样工作，然而，一般方案可以应用于（并且可以优化一点）大多数细胞系，因为它们都含有细胞膜。
关于如何确定全细胞裂解物的脂质含量的详细信息，读者推荐阅读Camus等人（2013）的综述文章。

食谱

PBS /蔗糖
将8.55g蔗糖溶解在100ml PBS中，使其最终浓度为0.25M蔗糖的PBS溶液
保持在4°C
20％碘克沙醇
10ml的碘克沙醇（60％）
20ml PBS /蔗糖保持在4°C
10％碘克沙醇
5ml的碘克沙醇（60％）
25ml PBS /蔗糖保持在4°C
2x Laemmli缓冲区
125mM tris-HCl（pH 6.8）
20％甘油 2.5％SDS
2.5mg/100ml Brilliant Blue G-250 使用前混合新鲜：950μl2x Laemmli缓冲液和50μlβ-巯基乙醇

致谢

这项工作得到Gladstone研究所和国家卫生研究院（R056 AI069090（MO）和P30 DK026743（MO）（加利福尼亚大学 - 旧金山肝脏中心）的资金支持，我们衷心感谢通过培训资助 T32 DK060414）从美国国家卫生研究所DAV。

参考文献

Camus，G.，Vogt，D.A.，Kondratowicz，A.S。和Ott，M。（2013）。脂滴和病毒感染方法细胞生物学 116 ：167-190。
Vogt，D.A.，Camus，G.，Herker，E.，Webster，B.R.，Tsou，C.L.，Greene，W.C.，Yen，T.S.and Ott，脂质小滴结合蛋白TIP47通过与病毒NS5A蛋白相互作用来调节丙型肝炎病毒RNA复制。/a> PLoS Pathog 9（4）：e1003302。
Yeaman，C.，Grindstaff，K.K.，Wright，J.R.and Nelson，W.J。（2001）。跨高尔基网络和质膜上的Sec6/8复合物调节哺乳动物细胞中胞吐作用的晚期。 J Cell Biol 155（4）：593-604