材料和试剂

具有过表达的目标蛋白质的转基因秀丽隐杆线虫（ C. elegans ）菌株
注意：根据蛋白质表达和抗体的特异性，该方案也可用于免疫沉淀内源性蛋白质。
OP50大肠杆菌（大肠杆菌）（ C. elegans 遗传中心）
盐酸三甲胺（Sigma-Aldrich，目录号：T5941）
Trizma碱（Sigma-Aldrich，目录号：T1503）
Tris碱（BioShop，目录号：TRS001）
细菌胰蛋白胨（BD，目录号：211705）
NaCl（BioShop，目录号：SOD002）
胆固醇（95％）（Sigma-Aldrich，目录号：C8503）
琼脂（Sigma-Aldrich，目录号：A1296）
Na 2 HPO 4（Sigma-Aldrich，目录号：S0876）
KH sub 2 PO 4（Sigma-Aldrich，目录号：P0662）
MgSO 4·7H 2 O（BioShop，目录号：MAG521）
EDTA（BioBasic，目录号：EB0185）
NP-40（BioShop，目录号：NON.505）
PMSF（Roche，目录号：10837091001）
（Sigma-Aldrich，目录号：S6508）
胃蛋白酶抑制剂A（Sigma-Aldrich，目录号：P4265）
NaF（Sigma-Aldrich，目录号：S7920）
cOmplete蛋白酶抑制剂混合物片剂（Roche，目录号：4693159001）
SDS（Caledon，目录号：7771）
甘油（BioShop，目录号：GLY001）
β-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M7154）
溴酚蓝（Sigma-Aldrich，目录号：B5525）
BCA蛋白测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific，目录号：23225）
硅化低结合末端200-1,000μl（Denville Scientific Inc.，目录号：P3193-S）
硅化低结合尖端200μl（Denville Scientific Inc.，目录号：P3010-S）
蛋白A/G PLUS-琼脂糖非缀合珠（Santa Cruz Biotechnology，目录号：SC-2003）
EZview Red ANTI-FLAG M2亲和凝胶结合珠（Sigma-Aldrich，目录号：F2426）
GFP多克隆抗体，兔（Genscript，目录号：A01388）
GFP单克隆抗体（B-2）（小鼠）（Santa Cruz Biotechnology，目录号：SC-9996）
驴抗兔IgG-HRP（Santa Cruz Biotechnology，目录号：SC-2313）
山羊抗小鼠IgG-HRP（Santa Cruz Biotechnology，目录号：SC-2005）
MYOB干混合（见配方）
MYOB板（见配方）
M9缓冲区（请参阅配方）
裂解缓冲液（见配方）
SDS-PAGE样品缓冲液（参见配方）

设备

冷冻微量离心机（Eppendorf，型号：5417R）
大型离心机（Eppendorf，型号：5810R）
旋转式搅拌器（Barnstead Thermolyne LabQuake，型号：C415110）
超声波仪（Branson Sonifier，型号：450）

设备

冷冻微量离心机（Eppendorf，型号：5417R）
大型离心机（Eppendorf，型号：5810R）
旋转式搅拌器（Barnstead Thermolyne LabQuake，型号：C415110）
超声波仪（Branson Sonifier，型号：450）
Resuspend worms by gentle inversion in 15 ml PBS.
Spin down worms and remove as much supernatant as possible.
Transfer up to 500 μl of packed worms using siliconized tips into a microcentrifuge tube.
Note: Siliconized tips are recommended to prevent adherence of worms.
Add up to 1 ml of ice cold lysis buffer (2x worm volume) and incubate on ice for 30 min.
Note: Worms can be flash frozen using liquid nitrogen and stored at -80 °C up to one week. For best results, continue with lysis immediately.

Lysis of worms

If performing lysis on same day, flash freeze worms in liquid nitrogen for 10 sec. If performing lysis on previously stored worm samples, continue to step B2.
Thaw frozen worms in room temperature water until a third of the frozen sample has melted.
Insert tip of sonicator halfway into sample and sonicate for 5-7 sec using 8 W power. Immediately flash freeze samples for 10 sec in liquid nitrogen.
Note: During sonication, do not allow samples to completely thaw during this process. It is important to keep the sample cold at all times to avoid protein degradation. Incubating samples on ice during sonication is optimal. One alternative that has been 以前报道（Ding等人，2005）是使用杵和研钵在液氮存在下粉碎蠕虫小球以破碎角质层，这可能有助于增加蛋白质产量和保存蛋白质的完整性。
重复步骤B2-3两次。最后快速冷冻后，让样品在室温下解冻，直到半融化
通过端到端搅拌在4℃下旋转样品30分钟
在4℃下，以13,000rpm旋转样品30分钟
将上清（溶解的蛋白质）转移到新的微量离心管并使用标准测量蛋白质浓度试剂盒（例如 BCA蛋白测定试剂盒）。

免疫沉淀

对于每个IP使用至少4mg的总蛋白。 8-10 mg蛋白质建议。用冰将蛋白质样品的体积调节至1ml 冷裂解缓冲液注意：建议不要在此步骤中存储要冻结的样品。
平衡琼脂糖珠通过在裂解缓冲液中洗涤三次，使用2x体积的珠浆液
1. 如果使用抗体偶联的珠，添加20-30微升平衡珠到蛋白质样品，并在4℃下搅拌孵育2-4小时注意：在4小时后孵育珠子没有改变我们手中的免疫沉淀效率。
2. 如果使用非共轭珠，首先向样品中加入抗体在4℃下搅拌孵育1小时。然后加入20-30μl 平衡的珠，并进一步温育1-3小时注意：我们有使用两个抗体结合的琼脂糖珠和非结合琼脂糖珠。我们没有检测到任何显着的差异 IP效率之间。
孵育后，用洗珠5次 1ml冰冷的裂解缓冲液，允许样品在搅拌下温育在4℃下洗涤2-5分钟
用50-100μlSDS-PAGE样品缓冲液洗脱蛋白质，煮沸5分钟，通过Western印迹分析注意：
1. 当进行蛋白质印迹时，推荐另外5-10分钟煮沸以从珠子洗脱蛋白质。
2. 对于样品制备的Western印迹的几个实施例使用这个协议，请参考Chan et al。（2014年）。特异性的免疫沉淀将取决于特异性的程度的抗体。为了获得最好的结果，预清除裂解液一种不相关的抗体以提高信噪比。而不管，可以执行几种不同类型的控制来评估特异性的免疫沉淀，包括进行用不含有表位的样品进行免疫沉淀兴趣（Chan等，2014），或包括模拟免疫沉淀对照，其中抗体不添加到样品前免疫沉淀。

食谱

注意：MYOB和M9的食谱取自Burns et al。（2006）。

MYOB干混物（对于370g）
27.5g盐酸 12克三价碱基
230克细菌用胰蛋白胨 100克NaCl
0.4克胆固醇（95％）
MYOB版（1升）
7.4g MYOB干混物
24克琼脂最多加1 L ddH 2 2 O
高压灭菌并倒入35毫升/10厘米板
M9缓冲液（1升）
6g Na 2 HPO 4
3g KH sub 2 PO 4 sub
5克NaCl
最多加1 L ddH 2 2 O
冷却至室温后，加入2ml 1M MgSO 4 7H 2 O 2 /
裂解缓冲液
25mM Tris-HCl（pH7.5） 100 mM NaCl
1mM EDTA
0.5％NP-40
1mM PMSF
1mM Na 3 VO 4 sub。
1μg/ml胃酶抑素-A
10mM NaF 1片/50ml缓冲液cOmplete蛋白酶抑制剂混合物片剂
ddH _{2到所需最终量}
SDS-PAGE样品缓冲液
100 mM Tris-HCl（pH 6.8）
2％SDS
20％甘油 4％β-巯基乙醇 0.02％溴酚蓝

致谢

这项工作得到加拿大癌症学会研究所（＃020511）和加拿大健康研究所（＃258898）授予PJR的支持。

参考文献

Burns，A.R.，Kwok，T.C.，Howard，A.，Houston，E.，Johanson，K.，Chan，A.，Cutler，S.R.，McCourt，P.and Roy，P.J。（2006）。在Caenorhabditis elegans中用于生物活性和靶标识别的小分子的高通量筛选。 Nat Protoc 1（4）：1906-1914。
Chan，K.K.，Seetharaman，A.，Bagg，R.，Selman，G.，Zhang，Y.，Kim，J.and Roy，P.J。（2014）。 EVA-1充当UNC-40共受体，以增强对MADD-4指导的吸引力 PLoS Genet 10（8）：e1004521。
Ding，L.，Spencer，A.，Morita，K.and Han，M。（2005）。发育时间调节因子AIN-1与miRISCs相互作用，可能靶向argonaute 蛋白ALG-1到C中的细胞质P体。 elegans 。 Mol Cell 19（4）：437-447。
Hall，R.A。（2005）。共免疫沉淀作为评价受体 - 受体或受体 - 蛋白相互作用的策略。在：George，S.R。，和Dowd，B.F。（eds）。 < em>蛋白质偶联受体 - 蛋白质相互作用。 John Wiley& Sons，Inc.，165-178。